一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用黑曲霉分离提取胆甾‑3,5‑二烯‑7‑酮的方法，是将黑曲霉的发酵菌丝体干燥、磨粉后得菌粉，将菌粉用丙酮提取制得黑曲霉提取液，并将黑曲霉提取液浓缩后制得浸膏，将浸膏层析后即可制得胆甾‑3,5‑二烯‑7‑酮；所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。本发明专利技术制备胆甾‑3,5‑二烯‑7‑酮属于一种生物来源，其具有底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得的特点。

A method for separation and extraction of cholesteryl -3,5- diene -7- ketone from Aspergillus niger

The invention discloses a method for isolating and extracting cholesterol_3,5_diene_7_one by Aspergillus niger. The bacterial powder is obtained by drying and grinding the fermented mycelium of Aspergillus niger. The bacterial powder is extracted by acetone to obtain Aspergillus Niger extract, and the extract is concentrated to obtain the extract. The extract can be prepared by chromatography. _diene_7 Cholesterol 3,5-diene 7-ketone is a biological source, which has the advantages of cheap substrate, simple extraction process, environmental protection in production process, less solvent residue, low pollution and easy access to culture substrate.

【技术实现步骤摘要】
一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法
本专利技术涉及一种提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，特别是一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法。
技术介绍
黑曲霉(Aspergillusniger)属于真菌中的一个常见种，能够在较宽的温度和pH范围及较低的湿度下生存，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉作为美国食品药品监督管理局(U.S.FDA)认证的一般公认安全(GRAS)菌种，广泛应用于工业生产有机酸、酶类，具有巨大的市场潜在价值。黑曲霉产柠檬酸、葡糖酸、没食子酸、草酸等，产酶方面主要是淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶。不仅如此，黑曲霉的众多代谢产物都具有多种重要应用价值。胆甾-3,5-二烯-7-酮，分子式为C27H42O，英文名称为cholest-3,5-dien-7-one。胆甾-3,5-二烯-7-酮属于甾体类化合物，是胆固醇中代谢物的一员，可作为胞液内ALDH同工酶有效的内源性抑制剂。有文献报道陈燕超等通过GC-MS法从蛤蟆油中检测出了胆甾-3,5-二烯-7-酮，但目前并没有关于从黑曲霉中分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法。本专利技术制备胆甾-3,5-二烯-7-酮属于一种生物来源，其具有底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得的特点。本专利技术的技术方案：一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，是将黑曲霉的发酵菌丝体干燥、磨粉后得菌粉，将菌粉用丙酮提取制得黑曲霉提取液，并将黑曲霉提取液浓缩后制得浸膏，将浸膏层析后即可制得胆甾-3,5-二烯-7-酮；所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCCNO：M206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillusnigerxj)，(保藏地址：中国武汉武汉大学)。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述方法具体步骤如下：1)浸膏的制备：将黑曲霉发酵菌丝体烘干至衡重，然后磨粉，得菌粉，将菌粉用丙酮提取得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩，得浸膏；2)硅胶柱层析：用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤(1)中的浸膏用丙酮溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩；3)反向柱层析：选取步骤(2)中极性适中浓缩组分用丙酮溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并用纯净水：甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩得目标粗品；4)再次硅胶柱层析：将步骤(3)中目标粗品再次进行硅胶柱处理；并用石油醚：乙酸乙酯：甲酸洗脱，收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，TLC层析显示为单一组分，浓缩干燥得白色粉末，即得胆甾-3,5-二烯-7-酮。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述步骤1)中，是将黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述步骤1)中，菌粉用丙酮以1：4的重量比，在温度50-100℃，压力0-1.0MPa条件下提取3次得黑曲霉提取液，时间为每次3h。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述浓缩是指采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述与硅胶拌样中的硅胶的尺寸为200-300目。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，步骤2)中，所述的用石油醚：丙酮梯度洗脱是依次按石油醚：丙酮＝1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1进行洗脱。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，步骤3)中，所述的用纯净水：丙酮梯度洗脱是依次按纯净水：甲醇＝100：0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100进行洗脱。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，步骤4)中，所述的用石油醚：乙酸乙酯：甲酸洗脱是按石油醚：乙酸乙酯：甲酸＝8:1：0.001进行洗脱。前述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，所述的洗脱中，洗脱剂的流速为15mL/min。本专利技术的有益效果与现有技术相比：1、本专利技术利用黑曲霉的菌丝体制备胆甾-3,5-二烯-7-酮，属于一种生物来源，可为解决胆甾-3,5-二烯-7-酮来源提供一条新途径。2、本专利技术的黑曲霉(Aspergillusnigerxj)的菌丝体来源可靠，底物廉价易得；且对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，提取工艺简单、易行，还易于培养和保存。3、本专利技术生产过程中，分离提取方法简单，重复性好，过程环保，溶剂残留少且易回收，减少了能源的消耗和废气的排放，大大降低了环境污染。黑曲霉(Aspergillusnigerxj)提取物胆甾-3,5-二烯-7-酮的鉴定：①样品的准备取上述所得白色粉末过100目筛后,采用EI-MS对所述样品和胆甾-3,5-二烯-7-酮标样进行波谱解析分析②EI-MS分析条件质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1624V；接口温度280℃；质量范围29～500amu；溶剂延迟时间：5.0min。③结论：通过EI-MS检测，从黑曲霉(Aspergillusnigerxj)孢子粉分离提取得到的样品Rf值与标准品一致，该单体化合物为胆甾-3,5-二烯-7-酮，结构为(Cholesta-3,5-dien-7-one)。结果见图1。附图说明图1是本专利技术方法提取的胆甾-3,5-二烯-7-酮EI-MS质谱分析图。图2是本专利技术方法提取的胆甾-3,5-二烯-7-酮EI-MS的结构式。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不作为对本专利技术限制的依据。本专利技术的实施例实施例1：一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，步骤如下：1)浸膏的制备：将黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉，将菌粉用丙酮以1：4的重量比，在温度75℃，压力0.5MPa条件下提取3次得黑曲霉提取液，时间为每次3h，并将该提取液采用旋转蒸发仪在温度50℃、压力为0.05MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干，得浸膏；2)硅胶柱层析：用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤(1)中的浸膏用丙酮溶剂溶解并与尺寸为250目的硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；依次按石油醚：丙酮＝1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1进行洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，采用旋转蒸发仪在温度50℃、压力为0.05MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干；3)反向柱层析：选取步骤(2)中极性适中浓缩组分用丙酮溶剂溶解与尺寸为250目的硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并依次按纯净本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用黑曲霉分离提取胆甾‑3,5‑二烯‑7‑酮的方法，其特征在于：是将黑曲霉的发酵菌丝体干燥、磨粉后得菌粉，将菌粉用丙酮提取制得黑曲霉提取液，并将黑曲霉提取液浓缩后制得浸膏，将浸膏层析后即可制得胆甾‑3,5‑二烯‑7‑酮；所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。

【技术特征摘要】
1.一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：是将黑曲霉的发酵菌丝体干燥、磨粉后得菌粉，将菌粉用丙酮提取制得黑曲霉提取液，并将黑曲霉提取液浓缩后制得浸膏，将浸膏层析后即可制得胆甾-3,5-二烯-7-酮；所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCCNO：M206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillusnigerxj)。2.根据权利要求1所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：1)浸膏的制备：将黑曲霉发酵菌丝体烘干至衡重，然后磨粉，得菌粉，将菌粉用丙酮提取得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩，得浸膏；2)硅胶柱层析：用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤(1)中的浸膏用丙酮溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩；3)反向柱层析：选取步骤(2)中极性适中浓缩组分用丙酮溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并用纯净水：甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩得目标粗品；4)再次硅胶柱层析：将步骤(3)中目标粗品再次进行硅胶柱处理；并用石油醚：乙酸乙酯：甲酸洗脱，收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，TLC层析显示为单一组分，浓缩干燥得白色粉末，即得胆甾-3,5-二烯-7-酮。3.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述步骤1)中，是将黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李祝，张素，冉江，肖洋，唐婧红，张钦语，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52