氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染中的应用制造技术

本发明专利技术涉及具有以下特征的基因序列或其片段和相应的肽或共同肽或蛋白在制备用于诊断和预防活性或潜伏性疾病的特异性生物标记物的应用：所述基因序列或片段属于目前被结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞中体外或离体诱导、抑制或保守的基因种类。

【技术实现步骤摘要】
氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染中的应用本专利技术涉及来自结核分支杆菌的氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染、诊断试剂盒及其疫苗中的应用。本专利技术更具体地涉及，具有以下特征的基因序列或其片段和相应的肽或共同肽或蛋白在制备用于诊断和预防活性或潜伏性疾病的特异性生物标记物的应用：所述基因序列或片段属于目前被结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞中体外或离体诱导、抑制或保守的基因种类。为了保证治疗的特异性、快速和有效，对结核感染和活性疾病发作的实验室诊断是非常重要的。关于活性结核病，目前的诊断方案是基于显微镜方法、培养物方法和分子方法。关于显微镜方法，需要样品中有高浓度(5-10000/ml)的分枝杆菌才能获得阳性结果，而且灵敏度通常低于60％，同时由于无法区分MTB和非结核分枝杆菌而导致特异性下降。关于培养物测试，所述应用无法保证在可接受的时间期限内作出医学报告。事实上，由于该细菌在体外生长缓慢，将其菌种置于固体或液体培养基中后(1)，只能在10-24天后观察到MTB菌落。另外，虽然培养物测试具有相当高的敏感性，但产生10-30％几率的假阴性结果，而且成本昂贵。分子生物学测试具有较高的敏感性和特异性，其敏感性相当于培养物测试，并能快速区分MTB和非结核分枝杆菌。然而，对于含低浓度分枝杆菌的样品，该测试灵敏度较低，但有意义的是那些样品原本在显微镜检测中呈阴性，另外，只有高度专业的实验室可进行该测试，因此成本昂贵。结核病仍然是全球公共安全的紧迫问题，其在高发国家中要计划有效的诊断和治疗方案缺乏必需的经济来源，而在低发工业国家中几乎无法诊断已感染的人群。目前，在高发国家中，TB活性诊断是基于MTB显微镜检测(敏感性40-90％)和培养物检测(灵敏度70-90％)，所述培养物检测需要等待2-6周时间。在低发病工业国家中，TB活性诊断是基于显微镜测试和培养物测试，对于无法区分非结核MTB和分枝杆菌的样品或显微镜测试呈阴性的样品，使用分子测试(灵敏度70-90％)。关于诊断潜伏性的或非活性的结核感染，常规的诊断测试是结核菌素皮肤测试，该测试是一种体外的即经济又快速的诊断测试，在过去的50年里已标准化，该测试使缜密并快速地检测感染成为可能，并使关于结核感染发生率和患病率的基础流行病调查得以实施。从公共安全的角度来看，结核菌素测试使感染率和患病率得以监控，因此获得全球疾病控制，从预防和临床医学的角度来看，可鉴别活性TB携带者的感染性接触，因而可建立抗结核感染的治疗性保护得以建立以预防新病例的发生。因此潜伏性感染诊断是高发国家和低发国家抗结核病的基础要素。各种细胞和分子免疫文献表明，体外接触MTB或其抗原可产生强烈的以产生大量干扰素-γ(IFN-γ)为特征的细胞介导反应。这说明，鉴定释放IFN-γ的T淋巴细胞或测定细胞因子(作为对分枝杆菌或抗原的应答)本身代表了一种相当于结核菌素检测的诊断已受感染的方法。关于该问题，近期上市了两款用于结核感染诊断的试剂盒，即QuantiFERON-TBGold和T-SPOTTB，所述试剂盒使用基于MTB基因属于MTB基因组RD1分化区的蛋白质和肽以在T淋巴细胞和循环血液中刺激产生IFN-γ。要在结核病高发国家中大规模使用，试剂盒成本相当高。两款市售试剂盒灵敏度相似，灵敏度和特异性范围分别是70-90％和80-95％。(2).另外，相比于常规的使用结核菌素的测试，在结核高发地区使用这些试剂盒的灵敏度和特异性仍存在争议。事实上，存在一些案例，其中皮肤测试被证明相比Quantiferon甚至更灵敏(3)，还存在两种测试恰好相当的案例。进行多次穿刺方法或Mantoux皮内注射的仍广为使用的结核菌素皮肤测试的主要限制是操作复杂且特异性不足。事实上，该测试包括第一次和第二次病人随访，分别用来由专业医疗人员注射结核菌素和读取检测结果。对于工作人员，一旦TB-HIV共同感染，会存在由皮内注射器引起的污染风险。关于结核菌素的测试特异性，已知纯化的结核菌素蛋白衍生物(纯化的蛋白衍生物，PPD)在用于抗结核疫苗时显示与牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovisBacillusCalmette-Guerin)(BCG)和各种环境中的非结核分枝杆菌有交叉反应性，显示与Kock杆菌基因组有高度序列同源性。因此，已接种BCG免疫的对象或近期与MTB毒性种类(即如研究实验室命名为H37Rv株(ATCC27294))接触的对象即使其反应强度比MTB感染对象低，也将显示结核菌素测试阳性。出于该原因，建立了区分MTB反应与抗牛型分枝杆菌(M.bovis)BCG或非结核分枝杆菌免疫产生的反应性的阳性强度限制。然而，所述强度限制特异性对于接种疫苗中的结核感染或要诊断的广泛接触环境中分枝杆菌的人群是不够的。关于预防MTB感染，目前唯一可用于结核病预防的疫苗是牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovisBacillusCalmette-Guerin)(BCG)(ATCC27291)，一种基于无毒性的牛型分枝杆菌(M.bovis)株的疫苗，全球已使用约75年。因此鉴于上述内容很明显存在以下需求，提供新的基于特异性肽的诊断试剂盒和疫苗以适用于克服目前现有技术的缺陷。有若干关于以下方面的研究，使用ELISPOT分析检测适合经刺激产生IFN-γ的血液单核细胞，对存在潜伏感染、或近期接触TB患者、和活性结核病中的MTB蛋白质和肽所产生的外周血淋巴细胞应答的研究。(7-15)ELISPOT技术可以通过使用针对细胞因子(例如IFN-γ)的致敏抗体刺激培养板上的单核血细胞，检测作为对刺激物应答的产生细胞因子T淋巴细胞频率，所述刺激物是一种或多种抗原，所述抗原可以是蛋白质、肽或其它靶分子。当抗原以肽的形式(8-12个氨基酸的长度)代表表位存在，与主要组织相容性复合物分子(MHC)结合时，T淋巴细胞通过抗原T细胞受体(TCR)识别抗原，所述主要组织相容性复合物分子是一种在所有有核细胞(指I类MHC分子)和抗原递呈细胞(例如树突细胞、巨噬细胞等)(指II类MHC分子)的原生质膜上的受体家族。在人MHC系统中存在各种同种变体：I类MHC分子有HLA-A、HLA-B和HLA-C；HLA-DP、II类MHC分子有HLA-DQ和HLA-DR。每种所述分子表现不同数目的等位基因变体。由于被T细胞TCR识别的抗原库与抗原递呈细胞MHC受体结合衍生自消化的抗原蛋白的肽的能力有关，所以所述肽识别为抗原并因此适于活化抗原性蛋白特异性T淋巴细胞的必需条件是其与MHC受体结合的易感性。编码HLA分子的基因属于人类基因中最多态性的基因。值得注意的是，因此所述分子的各等位基因产物之间的许多差异是碱基的多样性，这些碱基编码了与抗原肽结合区域有关的氨基酸序列修饰。这些序列多样性决定了HLA分子不同等位变体的结合特性，因而抗原肽库和所述等位基因变体可与T淋巴细胞TCR形成三分子复合物，并活化所述淋巴细胞。在MTB蛋白抗原识别中，需要指出的是分枝杆菌每个单独表位可与一个或多个HLA等位基因变体结合，但不必与群体中所有的等位基因变体结合。另外，由于非纯合子对象表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ的至少2个等位基因变体和HLA-DR的2至4个变体，所以在包括研究群体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的以下3种肽在制备在检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试中使用的生物标记物的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES。

【技术特征摘要】
2010.07.23 IT RM2010A0004111.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的以下3种肽在制备在检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试中使用的生物标记物的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES。2.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的至少一种肽在制备在检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试中使用的生物标记物的应用，所述肽选自下组：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG或SALLRRLSTCPPES。3.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的以下3种肽在制备用于体外诊断对象中受结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES。4.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与选自下组的至少一种来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的肽在制备用于体外诊断对象中受结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG或SALLRRLSTCPPES。5.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7以及以下3种肽在制备用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES，其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。6.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与选自下组的至少一种肽在制备用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG或SALLRRLSTCPPES，其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。7.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中的应用，所述混合物由LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES组成。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述对象是人。10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述对象是非人类的动物。11.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用还包括选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD的一种或多种分枝杆菌蛋白质的应用。12.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物以及选自下列的来自分枝杆菌的蛋白质：(a)ESAT；(b)CFP10；(c)TB7.7；和(d)PPD；在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中的应用，所述混合物由LAWITAVVPGLMV、GEIIFISGRLNG和SALLRRLSTCPPES组成。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述对象是人。15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述对象是非人类的动物。16.编码来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的核酸分子的混合物在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·玛丽安尼，M·阿米科圣丁，V·科里齐，C·萨尔蒂尼，
申请(专利权)人：塞尔雷斯蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU