一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法技术

本发明专利技术公开了一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法。该方法首次公开了采用多位点序列分型方法（MLST），对副猪嗜血杆菌进行分子分型的操作技术，本发明专利技术提取该病原菌基因组DNA，通过7个看家基因（rpoB、atpD、g3pd、infB、mdh、_6pgd、frdB）筛选、扩增、检测与测序，采用CExpress和DNAMAN软件对测序结果进行拼接、多序列比对与分析，再通过在线副猪嗜血杆菌MLST分型数据库获得菌株序列型（ST）。本分型技术所使用的扩增引物为首次采用，PCR反应体系和条件为自行优化，该技术流程可以用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究。

【技术实现步骤摘要】
一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法
本专利技术涉及一种动物病原菌分子分型技术，具体涉及一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法。
技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuisstrains,HPS)是巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性菌，主要危害仔猪和青年猪。该病菌是猪上呼吸道的一种常在细菌，在特定条件下可以侵入机体引起严重的全身性疾病，其主要特征是以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主，该病原引起的疾病又被称为“革拉氏病”。目前，副猪嗜血杆菌病在我国乃至全世界广泛流性，给养猪业带来严重的经济损失，是世界性病害之一，已引起人们广泛的关注。此外，副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，且血清型众多，每个血清型之间缺乏免疫交叉性，因此至今仍没有一个很好的控制副猪嗜血杆菌病流行的方法。多位点序列分型(MLST)技术是直接利用5—10个看家基因的核普酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因，进化相对缓慢，通过序列中碱基的变化可反映菌株之间的遗传关系和进化关系。在MLST结果分析中，每个单一的核普酸差异即可视为一个新的等位基因(allele)，把每个来自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯数字编号，由此使得每个菌株中看家基因的等位基因都有相应的编号，最终可得到该菌株的由一串数字组成的等位基因号码，即该菌株的序列型(SequenceType，ST)。通过MLsT分型不仅可以判断菌株之间的亲缘关系，而且还可以推断它们是否有共同祖先，因此MLST技术被广泛地用于细菌病原菌的分类中。此外，多位点序列分型技术也可用于病原菌株遗传多样性和分子进化研究，构建系统发育树。由于该方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同实验室或实验室内部的结果可比性及重复性较差的缺陷，所以相关数据结果可通过网络实现数据共享和对比。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本专利技术的目的在于建立副猪嗜血杆菌的多位点序列分型技术体系，提供一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法。用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是副猪嗜血杆菌看家基因筛选确定、引物的设计、PCR反应体系和条件的确定、看家基因序列的确定、看家基因比对与分析、等位基因号与分型号的申请。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种副猪嗜血杆菌分子分型方法，该方法成功提取细菌基因组DNA，并设计引物，采用优化的PCR反应体系和条件进行扩展，用CExpress软件对正、反向测序结果进行拼接，截取准确的序列片段，将片段于在线副猪嗜血杆菌MLST分型数据库中进行比对，利用DNAMAN软件找到拼接序列的反向互补序列，按数据库中的要求，截取相应的序列片段，确定7对看家基因序列，获得各个菌株序列型(ST)。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现。一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法，包括扩增引物对组合样品在25μL反应体系中进行PCR扩增，将扩增产物进行检测和测序，用CExpress软件将正、反向看家基因序列进行拼接，利用在线公共副猪嗜血杆菌MLST分型数据库对拼接后的序列进行比对，获得菌株序列型。进一步的，扩增引物对组合中各引物对序列为：atpD：atpDFCAAGATGCAGTACCAAAAGTTTAatpDRACGACCTTCATCACGGAATinfB：infBFCCTGACTAYATTCGTAAAGCinfBRACGACCTTTATCGAGGTAAGmdh：mdh-upTCATTGTATGATATTGCCCCmdh-dnACTTCTGTACCTGCATTTTGrpoB：rpoBFTCACAACTTTCICAATTTATGrpoBRACAGAAACCACTTGTTGCG6pgd：6pgdFGATGCATTATTACCGCACTTA6pgdRCGTTGATCTTTGAATGAAGAg3pd：3gpdFGGTCAAGACATCGTTTCTAAC3gpdRTCTAATACTTTGTTTGAGTAACCfrdB：frdBFCATATCGTTGGTCTTGCCGTfrdBRTTGGCACTTTCGATCTTACCTT。进一步的，用本专利技术中设计的7对看家基因的扩增引物和PCR体系和条件对看家基因进行PCR扩增，产物采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，将扩增产物进行纯化和测序，用CExpress软件对正、反向测序结果进行拼接，截取准确的序列片段，将片段于在线副猪嗜血杆菌MLST分型数据库中进行比对，利用DNAMAN软件找到拼接序列的反向互补序列，按数据库中的要求，截取相应的序列片段，确定7对看家基因序列，根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，使每个菌株获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合的序列型(ST)。进一步的，本方法所包括的7对看家基因的名称、功能和引物序列如下表1所示：表1进一步的：所述PCR扩增的25μL反应体系如下：聚合酶链式反应PCR循环条件为：预变性温度95℃，时间5min；变性温度95℃，时间30s；各看家基因退火温度见表2所示，30s；延伸温度72℃，90s；一共30个循环，最后延伸的温度是72℃，10min。表2进一步的：该方法包括如下步骤：(1)细菌基因组DNA的提取按照DNA提取试剂盒说明步骤，提取细菌基因组DNA；(2)看家基因确定筛选出细菌7对看家基因rpoB、atpD、g3pd、infB、mdh、_6pgd、frdB进行试验；(3)看家基因扩增、检测与测序根据引物对组合，见表1所示，进行看家基因扩增；检测与测序：PCR扩增后的产物采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为lxTAEBuffer、电压为120V的条件下电泳20～25min，染色25～30min，拍照，对基因组DNA进行纯化和全基因组测序；(4)数据分析采用CExpress软件对正、反向测序结果进行拼接，截取准确的序列片段，将片段于在线副猪嗜血杆菌MLST分型数据库中进行比对，利用DNAMAN软件找到拼接序列的反向互补序列，按数据库中的要求，截取相应的序列片段，每个基因位点上的特定序列定义为一个等位基因，不同等位基因之间可能有一个或多个碱基差异；根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，这样每个菌株在这个看家基因位点上就获得了相应的等位基因号，这样每个菌株都获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合，即菌株的序列型。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：本专利技术经过反复试验，筛选确定了7对看家基因组合，设计引物进行PCR扩增，用CExpress软件对正、反向测序结果进行拼接，截取准确的序列片段，用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对与分析，在副猪嗜血杆菌MLST分型网站上申请获得菌株序列型(ST)。充分利用公共数据库数据，对菌株进行分型，结果反馈快速高效。本专利技术方法可用于副猪嗜血杆菌分类鉴定和遗传多样性研究，目的是解决该病菌因分类和变异情况较复杂给实际工作中带来一些问题，研究探讨副猪嗜血杆菌群体遗传结构及亲缘关系，为从遗传进化的角度去认识副猪嗜血杆菌，从分子水平对它们进行分类与鉴定，进一步开展该病菌致病力分析与致病机本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法，其特征在于：引物对组合样品在25μL反应体系中进行PCR扩增，将扩增产物进行检测和测序，用CExpress软件将正、反向看家基因序列进行拼接，利用在线公共副猪嗜血杆菌MLST分型数据库对拼接后的序列进行比对，即获得菌株序列型。

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法，其特征在于：引物对组合样品在25μL反应体系中进行PCR扩增，将扩增产物进行检测和测序，用CExpress软件将正、反向看家基因序列进行拼接，利用在线公共副猪嗜血杆菌MLST分型数据库对拼接后的序列进行比对，即获得菌株序列型。2.根据权利要求1所述一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法，其特征在于：所述扩增引物对组合中各引物对组合序列为：atpD：atpDFCAAGATGCAGTACCAAAAGTTTAatpDRACGACCTTCATCACGGAATinfB：infBFCCTGACTAYATTCGTAAAGCinfBRACGACCTTTATCGAGGTAAGmdh：mdh-upTCATTGTATGATATTGCCCCmdh-dnACTTCTGTACCTGCATTTTGrpoB：rpoBFTCACAACTTTCICAATTTATGrpoBRACAGAAACCACTTGTTGCG6pgd：6pgdFGATGCATTATTACCGCACTTA6pgdRCGTTGATCTTTGAATGAAGAg3pd：3gpdFGGTCAAGACATCGTTTCTAAC3gpdRTCTAATACTTTGTTTGAGTAACCfrdB：frdBFCATATCGTTGGTCTTGCCGTfrdBRTTGGCACTTTCGATCTTACCTT。3.根据权利要求2所述一种副猪嗜血杆菌多位点序列分子分型的方法，其特征在于：所述PCR扩增的25μL反应体系如下：双蒸水18μl10×脱氧核糖核苷三磷酸1μl10×缓冲液2.5μl上游引物(+)1μl下游引物(-)1μlTaqDNA聚合酶0.5μl细菌样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫鹤，万锈琳，李春玲，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44