一种假交替单胞菌快速PCR检测方法技术

本发明专利技术提供一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，以假交替单胞菌基因为检测靶向基因，检测步骤包括引物合成、提取DNA、PCR反应、电泳检测和结果判定。此检测方法为国内首次公开的紫菜绿斑病病原检测方法，其检测准确率高，用假交替单胞菌人工感染条斑紫菜，以三对特异引物分别检测侵染紫菜，阳性检出率为100％。检测灵敏度高，采用本发明专利技术的三对引物均能特异性的检测假交替单胞菌，检测灵敏度分别为37CFU、3.7CFU、37CFU的细菌和2.37pg、23.7fg、2.37pg的DNA。

A rapid PCR detection method for Pseudomonas alternata

The invention provides a rapid PCR detection method for Pseudoalternating bacteria, taking the Pseudoalternating bacteria gene as the detection target gene. The detection steps include primer synthesis, DNA extraction, PCR reaction, electrophoresis detection and result determination. This method is the first public detection method of Porphyra green spot pathogen in China. The detection accuracy is high. Pseudoalternating bacteria were used to infect Porphyra yezoensis artificially and three pairs of specific primers were used to detect the infection of Porphyra yezoensis. The positive detection rate was 100%. The three pairs of primers of the present invention can specifically detect Pseudoalternating bacteria. The detection sensitivity of the three primers are 37 CFU, 3.7 CFU, 37 CFU bacteria and 2.37 pg, 23.7 FG and 2.37 PG DNA, respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种假交替单胞菌快速PCR检测方法
本专利技术涉及水产养殖动物的微生物学及病害学领域，具体涉及一种引起条斑紫菜绿斑病的假交替单胞菌快速PCR检测方法。
技术介绍
紫菜是世界上重要的经济藻类，全世界大约有134种。其味道鲜美，含有丰富的维生素、矿物质和抗氧化成分，同时它又是低能量的食物，富含膳食纤维。能够改善盲肠环境并且提高有益微生物区系、降压降血脂、抗肿瘤活性[7]、提高巨噬细胞活性，具有潜在的制药、药用和研究价值。因此紫菜又有“营养宝库”的美称，深受城乡人民喜爱。随着条斑紫菜栽培业的发展，其病害问题愈发突出，成为制约产业发展的一大障碍。大量研究表明，微生物是引起紫菜病烂的重要因素。1968年绿斑病在日本首次报道，随后日本学者Yoshifusa等从患病紫菜中分离出微球菌(Micrococcissp.)、假单胞菌(Pseudomonassp.)以及弧菌属(Vibrio)的细菌。闫咏等通过实验分离、鉴定确认一株柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonascitrea)是条斑紫菜绿斑病的病原。随后有多名学者对绿斑病的病程及病原进行了研究。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)是革兰氏阴性菌，属于变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，交替单胞菌目(Alteromonadales)，假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)。最初根据发酵碳水化合物的能力将从海洋中分离出的异养运动型革兰氏阴性菌细菌分为两类，具有发酵能力的为假单胞菌属(Pseudomonas)，而非发酵类的最初命名为交替单胞菌属(Alteromonas)。1995年Gauthier等通过16SrRNA系统进化分析提出假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)应从交替单胞菌属(Alteromonas)中分离出来，被人们广泛认可。假交替单胞菌是一种条件致病菌，广泛存在于海洋底泥中，同时在许多海洋生物体内都有分布，如海带、紫菜、鱼类、对虾等，具有十分重要的生态意义。于敏研究金丽假交替单胞菌JG1发现其对大多数弧菌具有较好的抑制效果，并且能够产生多种诸如抑菌蛋白及小分子化合物的抑菌物质，活性与抗生素相当。Holmstrom等的研究显示假交替单胞菌能够一定程度上减少无脊椎动物幼体表面污损及藻类孢子附着。通过产生一系列生物活性物质与其他菌种相互作用，防止其过量生长，共同维持生物被膜菌群的平衡。假交替单胞菌tbzcY1是由本实验室牟宗娟从山东日照岚山海区患绿斑病的条斑紫菜中分离鉴定，该病原引起条斑紫菜迅速发病，感染初期在叶状体上可见少量红色小点，随后颜色变为铁红色，1-3天后斑点扩大，逐渐变为浅灰绿色，部分位置出现裂痕和孔洞，最终整个叶片崩解。随着紫菜栽培业的发展，海区养殖密度增加，水流交换不畅，加之气温升高，盐度降低，干出时间不足，导致紫菜病烂愈发严重，而微生物也是引起紫菜绿斑病的不可忽视的重要因素之一。建立一种快速、灵敏、准确的检测方法可以及时的发现病原，为防治该病提供宝贵的时间，最大程度的降低其造成的危害。
技术实现思路
为了解决现有条斑紫菜绿斑病病害严重，检测难度大，检测精准性差的问题，我们提出了一种假交替单胞菌快速PCR检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：为实现上述目的，本专利技术提供一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，以假交替单胞菌基因为检测靶向基因。优选地，上述假交替单胞菌为引起条斑紫菜绿斑病的病原菌。检测步骤如下：(1)引物合成：合成特异性引物pws-dnaN13或pws-dnaA2或pcs-dnaN2；(2)提取患病条斑紫菜的DNA：取紫菜在无菌海水中荡洗三次以上，吸干表面水分后，分别称取100mg置于灭菌研钵中，液氮研磨后提取和纯化紫菜基因组，测定DNA浓度后，置于-20℃备用；(3)将步骤(2)提取的DNA与对照DNA以步骤(1)中三对特异性引物中的一对进行PCR反应；(4)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外成像仪下观察拍照；(5)结果判定：采用pws-dnaN13作为引物时，产物扩增片段为721bp，采用pws-dnaA2作为引物时，产物扩增片段为386bp，采用pcs-dnaN2作为引物时，产物扩增片段为253bp。优选地，上述特异性引物序列如下：优选地，上述PCR反应体系如下：PCR缓冲液；MgCl2终浓度2.5mmol/L；dNTP终浓度0.2mmol/L；TaqDNA聚合酶1unit；上下游引物终浓度均为0.5μmol/L；模板1.0μl；加ddH2O至终体积50μl。优选地，上述PCR反应条件如下：95℃预变性5min后，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸48s、20s，35个循环，72℃充分延伸7min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)此检测方法为国内首次公开的紫菜绿斑病病原检测方法，其检测准确率高，用假交替单胞菌人工感染条斑紫菜，以三对特异引物分别检测侵染紫菜，阳性检出率为100％。(2)检测灵敏度高，采用本专利技术的三对引物均能特异性的检测假交替单胞菌，检测灵敏度分别为37CFU、3.7CFU、37CFU的细菌和2.37pg、23.7fg、2.37pg的DNA。附图说明图1为本专利技术引物pws-dnaA2(A)、pcs-dnaN2(B)和pws-dnaN13(C)特异性检验结果图；其中：1：PseudoalteromonastbzcY1；2：Pseudoalteromonasphenolica20170908GY4s-1(2)；3：Pseudoalteromonasvirvidis20170922YZ1-1w-6(2)；4：Pseudoalteromonaspeptidolytica20170923DT1-1w-2(2)；5：Pseudoalteromonaspiscida20170920GY7-1w-1(2)；6：Pseudoalteromonasluteoviolacea20170920GY8-1w-8(2)；7：Pseudoalteromonasrubra20170920GY7-1s-11(2)-1；8：PseudoalteromonasflavipulchraCDM8；9：VibrioanguillarumATCC43305；10：VibrioanguillarumATCC43307；11：Vibrioparahemolyticus；12：DL2000Marker13：Vibrioharveyi；14：Vibriovulnificus；15：1.1608；16：1.1607；17：EdwardsiellatardaLSE6；18：AeromonassalmonicidaLZST-4；19：Pseudomonaslibanensis20170922YZ1-4w-9(2)；20：Alteromonasmacleodii20170921RD2-102ww-1(2)；21：Maribactorgoseongensis20170921RD2-102ws-12(2)；22：Staphylococcusaureus；23：EscherichiacoliDH10B；24：阴性对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，其特征在于：以假交替单胞菌基因为检测靶向基因。

【技术特征摘要】
1.一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，其特征在于：以假交替单胞菌基因为检测靶向基因。2.如权利要求1所述的一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，其特征在于：所述假交替单胞菌为引起条斑紫菜绿斑病的病原菌。3.如权利要求1所述的一种假交替单胞菌快速PCR检测方法，其特征在于：步骤如下：(1)引物合成：合成特异性引物pws-dnaN13或pws-dnaA2或pcs-dnaN2；(2)提取患病条斑紫菜的DNA：取紫菜在无菌海水中荡洗三次以上，吸干表面水分后，分别称取100mg置于灭菌研钵中，液氮研磨后提取和纯化紫菜基因组，测定DNA浓度后，置于-20℃备用；(3)将步骤(2)提取的DNA与对照DNA以步骤(1)中三对特异性引物中的一对进行PCR反应；(4)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外成像仪下观察拍照；(5)结果判定：采用pws-dnaN13...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，莫照兰，阎永伟，李贵阳，杨慧超，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37