接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法，属于生物检测技术领域。该制备方法为以纳米纤维膜为基材层在其表面通过原子转移自由基聚合接枝引入甘露糖聚合物，然后再与功能化异硫氰酸荧光素复合反应，制备得到大肠杆菌检测膜，其中，功能化异硫氰酸荧光素为异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的反应物。该检测膜只对大肠杆菌进行特异性设别，方便快速准确的检测大肠杆菌。

Detection of membrane and bacteria for preparation of Escherichia coli by graft copolymerization

The invention discloses a method for preparing E. coli detection membrane by graft copolymerization and bacterial detection, belonging to the technical field of biological detection. The preparation method is to prepare E. coli detection membrane by atom transfer radical polymerization grafting mannose polymer onto the surface of nanofiber membrane as substrate layer and then reacting with functionalized fluorescein isothiocyanate, in which the functionalized fluorescein isothiocyanate is used as fluorescein isothiocyanate and bovine serum egg. White reactants. The detection membrane is specific for Escherichia coli, and is convenient, rapid and accurate for detection of E. coli.

【技术实现步骤摘要】
接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法
本专利技术涉及大肠杆菌的检测，属于生物检测
，具体地涉及一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法。
技术介绍
大肠杆菌是人和动物肠道内最常见的一种细菌，主要通过受污染的食品进行传播，例如生鲜奶和生的或者未煮熟的肉制品类，受粪便污染的水或者其它食物及食物制备期间的交叉感染也将导致感染。大多数大肠杆菌是不致病的，少数具有毒性，可引起疾病，如肠出血性大肠杆菌，在小儿中常常导致溶血性尿毒综合症，威胁生命。然而大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。国家规定，每毫升饮用水中的菌落总数小于100，每100毫升水中不得检出总大肠菌群。对大肠杆菌的检测，通常采用琼脂平板培养计数法，但是共需2～3d才能完成，这种方法费时且工序繁杂。生物传感器作为近年来兴起的快速检测食品品质的方法，其采用固定化生物活性物质作为催化剂，结合使用价值昂贵的试剂，耗时少，准确度较高，缺点是成本也较高。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种方便快速准确检测大肠杆菌浓度的接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法。为实现上述目的，本专利技术公开了一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，它包括如下步骤：a)制备表面活化的纳米纤维膜层：取纳米纤维膜浸渍于氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)得到的所述表面活化的纳米纤维膜与溴异丁酰溴反应得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；c)制备表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜：取步骤b)得到的所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与甘露糖单体发生接枝共聚反应，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜；d)制备异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；e)制备大肠杆菌检测膜：取步骤c)得到的所述表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，制备得到大肠杆菌检测膜。进一步优选的，所述步骤c)的具体反应过程如下：所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与溴化亚铜混合后，在惰性气体环境中，与甘露糖单体、二联吡啶的甲醇混合液，在80℃的恒温水浴下振荡反应10～20h，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜。再进一步优选的，所述步骤c)中，所述溴化亚铜与甘露糖单体、二联吡啶之间的物质的量之比为0.5～2:50～200:0.5～2。更进一步优选的，所述步骤d)的异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液的制备过程如下：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合后置于水中，所述异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的质量比为4～8:100，控制温度为4℃，搅拌反应4～6h，去除未反应完全的异硫氰酸荧光素后调节溶液的pH为7～9，得到被异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白水溶液。更进一步优选的，所述步骤e)的具体反应过程如下：取步骤c)得到的所述表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制温度为4℃，反应10～20min，取出，采用清水洗涤至少2次，干燥后制备得到大肠杆菌检测膜。更进一步优选的，所述步骤a)中，所述纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm，所述纳米纤维膜的材质为聚乙烯-聚乙烯醇。上述在所述纳米纤维膜表面的接枝率不低于15％，该接枝率是按照甘露糖聚合物与异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白的质量和来计算的。作为本专利技术技术方案的优选，所述步骤b)的具体反应过程为，将所述表面活化的纳米纤维膜浸渍在溴异丁酰溴的甲苯或正戊烷溶液中，控制反应温度为25～35℃，反应时间为30～90min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜，所述溴异丁酰溴的甲苯或正戊烷溶液的体积百分比为1～5％。作为本专利技术技术方案的优选，所述异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白的质量比为5～7:100。作为本专利技术技术方案的优选，所述异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白的质量比为6:100。作为本专利技术技术方案的优选，在异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白水溶液中，所述异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，所述牛血清蛋白的浓度为100mg/mL。作为本专利技术技术方案的优选，取0.5～2mmol的溴化亚铜和表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，在氮气气体环境中，加入50～200mmol的甘露糖单体、0.5～2mmol的二联吡啶的甲醇混合液，在恒温水浴下振荡反应，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜。为了更好的实现本专利技术的技术方案，本专利技术还公开了一种细菌检测的方法，它包括如下步骤：1)采用上述制备的细菌检测膜，裁剪成长×宽＝3cm×1cm；2)将所述步骤1)的检测膜浸入3mL待测溶液中；3)待5分钟后观察膜的颜色，通过肉眼观察膜颜色的变化来定性判断细菌的浓度：若膜颜色为无色，细菌的总数大于105CFU/mL；若膜颜色为浅黄绿色，细菌的总数为103～104CFU/mL；若膜颜色为深黄绿色，细菌的总数为10～103CFU/mL；若膜颜色在黄绿色基础上显橙色，细菌的总数为小于10CFU/mL。进一步地，定量检测的方法包括如下步骤：4)选用上述制备的细菌检测膜，裁剪成长×宽＝3cm×1cm；5)取待测溶液，测定其荧光强度值，然后将所述步骤4)的检测膜浸渍于待测溶液中，在5分钟以内的每相等的时间间隔之间测定待测溶液的荧光强度值，由前后变化的数值计算荧光强度变化速率；6)将所述步骤5)的荧光强度变化速率的数值代入标准曲线中，得到待测样品的细菌浓度值。更进一步地，所述步骤6)中的标准曲线为大肠杆菌标准溶液中荧光强度变化速率与细菌浓度对数值之间的线性关系图，绘制过程如下：取五份大肠杆菌悬浮液的浓度为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的标准溶液，分别测定其荧光强度值，然后取5个完全相同的所述步骤4)的检测膜分别浸渍于上述标准溶液中，分别在相等的时间间隔之间测定标准溶液的荧光强度值，由多个前后变化的荧光强度的差值计算荧光强度的变化速率，以荧光强度的变化速率为纵坐标，以对应的标准溶液浓度的对数值为横坐标，得到标准曲线。本专利技术制备方法的原理：本专利技术的制备方法为在纳米纤维膜表面接枝共聚甘露糖的聚合物，甘露糖聚合物的分子表面含有羟基和羧基，而异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白表面也依然含有丰富的氨基、羧基等，利用基团之间的氢键相互作用使得甘露糖聚合物与牛血清蛋白发生非特异性吸附，最终制备得到可检测出大肠杆菌的细菌检测膜。本专利技术细菌检测方法的原理：大肠杆菌表面含有可特异性识别甘露糖的蛋白结构，因此溶液中如果有大肠杆菌，其能够诱发检测膜表面的牛血清蛋白在膜表面解吸附，带动异硫氰酸荧光素的解吸附，其中，异硫氰酸荧光素进入溶液中，而异硫氰酸荧光素具备荧光特性，使得检测膜表面的颜色由有颜色到逐渐褪去，实现大肠杆菌的浓度范围的检测，而从检测膜上解离下来的牛血清蛋白和异硫氰酸荧光素进入溶液中，其中，溶液中异硫氰酸荧光素的量与大肠杆菌的浓度成正比，因此，可以通过测定溶液中荧光强度的增加值，定量的检测大肠杆菌的浓度。有益效果：本专利技术的细菌检测膜可在5min内快速准确的检测大肠杆菌细菌的浓度范围，与传统的培养皿方法相比，检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a)制备表面活化的纳米纤维膜：取纳米纤维膜浸渍于氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)得到的所述表面活化的纳米纤维膜与溴异丁酰溴反应得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；c)制备表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜：取步骤b)得到的所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与甘露糖单体发生接枝共聚反应，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜；d)制备异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；e)制备大肠杆菌检测膜：取步骤c)得到的所述表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，制备得到大肠杆菌检测膜。

【技术特征摘要】
1.一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a)制备表面活化的纳米纤维膜：取纳米纤维膜浸渍于氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)得到的所述表面活化的纳米纤维膜与溴异丁酰溴反应得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；c)制备表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜：取步骤b)得到的所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与甘露糖单体发生接枝共聚反应，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜；d)制备异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；e)制备大肠杆菌检测膜：取步骤c)得到的所述表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，制备得到大肠杆菌检测膜。2.根据权利要求1所述接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤c)的具体反应过程如下：所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与溴化亚铜混合后，在惰性气体环境中，与甘露糖单体、二联吡啶的甲醇混合液，在80℃的恒温水浴下振荡反应10～20h，制备得到表面接枝甘露糖聚合物的纳米纤维膜。3.根据权利要求2所述接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤c)中，所述溴化亚铜与甘露糖单体、二联吡啶之间的物质的量之比为0.5～2:50～200:0.5～2。4.根据权利要求1所述接枝共聚制备大肠杆菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤d)的异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液的制备过程如下：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合后置于水中，所述异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的质量比为4～8:100，控制温度为4℃，搅拌反应4～6h，去除未反应完全的异硫氰酸荧光素后调节溶液的pH为7～9，得到被异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白水溶液。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，鲁振坦，余振国，张佳琪，王雯雯，
申请(专利权)人：武汉纺织大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42