【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及芽孢漆酶，具体涉及一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法。
技术介绍
1、漆酶是含铜氧化还原酶的一种，属于氧化镁的蓝铜家族。各类漆酶非常普遍的存在于大自然中，大量植物中均存在漆酶，几乎所有的真菌类微生物中都可以产生漆酶。些种类繁多的漆酶有的是分泌的酶，也有一些被定位存在于细胞内，因其产生的物种不同而不同。漆酶能通过特异性催化作用快速将酚类、芳胺、芳香羧酸等有机芳香族类化合物降解，漆酶可催化降解的底物范围广、催化效率高，是一种天然无污染的酵素。通过利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的特异性催化降解的特性，针对漆酶进行深度的研究以及合理的开发利用，能够大大减少催化降解过程中化学药品的使用量，除了能降低工业生产成本也能更好地减少环境污染，保护生态。
2、芽孢杆菌属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是一类能产生抗力内生孢子的革兰氏阳性菌，细胞呈杆状且外层覆盖大量的吡啶二羧酸钙。其皮层位于核心和芽孢壳之间，含丰富的肽聚糖；核心是一种高度浓缩的、惰性的染色体；最外层的外壁为一层肽聚糖壁，且一层或多层的成分为蛋白质的芽孢衣。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强，对染料不易着色，稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温，能长期耐受60℃高温，在温度120℃下能存活20min，且耐酸碱，在胃酸环境中能保持活性，这可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。同时还具有广谱杆菌活性，能产生细菌素，抑制病原菌。目前应用较多的有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等类型。
3、目前漆酶的获取主要是从漆树或微生物的发酵液中获取，生
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服
技术介绍
中存在的上述缺陷或问题，提供一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，以芽孢杆菌为远离进行漆酶的提取，原料廉价丰富、获取途径简便，有效扩展了漆酶的制备来源，同时操作简便，制备过程简单，能够有效提高漆酶的制备、提取效率。
2、为达成上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，包括以下步骤：步骤一、将在lb固体培养基上纯化培养的芽孢杆菌单菌菌落转接至lb液体培养基中，经过夜活化培养后，将菌液转接至lb固体培养基上均匀涂布后在恒温培养箱中静置培养；步骤二、将步骤一获得的菌体用涂布棒刮下并溶于无菌水中，用溶菌酶水解后依次用均含有蛋白酶抑制剂的氯化钠水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液和无菌水洗涤；步骤三、将洗涤得到的菌液离心后取芽孢杆菌悬浮于含有苯甲基磺酰氟的磷酸钾缓冲溶液中，并加入钢珠后反复冻融数次，得到芽孢杆菌样品；步骤四、将芽孢杆菌样品进行破碎，并在离心后取上清液经过滤后得到芽孢漆酶。
4、进一步的，还包括步骤五：用无菌水使层析柱达到平衡状态后，将过滤后的芽孢漆酶通入层析柱，再利用蛋白洗脱液对层析柱中的芽孢漆酶进行洗脱并将不同峰值处的样品分别收集，即可得到纯化漆酶。
5、进一步的，所述步骤一为：将在lb固体培养基上纯化培养的芽孢杆菌单菌菌落转接至lb液体培养基中，在37℃、150rpm条件下过夜活化培养后，取300ml菌液转接至12cm培养皿lb固体培养基上均匀涂布后在恒温培养箱中28℃静置培养5天。
6、进一步的，所述步骤二为：将步骤一获得的菌体用涂布棒刮下并溶于无菌水中，用0.5mg/ml的溶菌酶37℃水解1小时，再依次用含有蛋白酶抑制剂的1m/l氯化钠水溶液、
7、0.14m/l氯化钠水溶液、0.1％摩尔分数的十二烷基硫酸钠水溶液和无菌水洗涤。
8、进一步的，所述步骤三为：将洗涤得到的菌液离心后取芽孢杆菌悬浮于含有1mm/l苯甲基磺酰氟的0.05m/l、ph为7的磷酸钾缓冲溶液中，并加入直径5mm钢珠后在-70℃条件下反复冻融三次，得到芽孢杆菌样品。
9、进一步的，所述步骤四中，将芽孢杆菌样品用直径5mm钢珠在30hz的频率下破碎10分钟。
10、进一步的，所述步骤五中，所述蛋白洗脱液由以下方法制得：将0.5mol/lna2hpo457.7ml与0.5mol/lnah2po4 42.3ml混合后用蒸馏水定容至1000ml，再加入0.15mol/l的nacl，即可配置成蛋白洗脱液。
11、由上述对本专利技术的描述可知，相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
12、本专利技术提供的从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，以芽孢杆菌为远离进行漆酶的提取，原料廉价丰富、获取途径简便，有效扩展了漆酶的制备来源，同时操作简便，制备过程简单，能够有效提高漆酶的制备、提取效率。
13、相比于常规的漆酶提取方法，本专利技术在对芽孢杆菌进行预处理后，加入钢珠并冻融数次，之后再对芽孢杆菌样品进行破碎，在经过破碎后，漆酶活性明显增强，得到的芽孢漆酶由于芽孢杆菌结构本身具有强大的抗逆性，芽孢漆酶相较于常规方法制备得到的纯化漆酶具有更强的温度稳定性和ph稳定性；之后再对破碎后的芽孢漆酶进行层析纯化，在层析过程中其他蛋白被分离，漆酶的纯度得到提升。
14、本专利技术提供的从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，在步骤四中将芽孢杆菌样品用直径5mm钢珠在30hz的频率下破碎10分钟，该破碎参数下的芽孢漆酶能够具有最佳的活性，同时又不会被破碎过程中产生的热量影响活性。
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1.一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，还包括步骤五：
3.如权利要求2所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤一为：
4.如权利要求3所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤二为：
5.如权利要求4所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤三为：
6.如权利要求1-5任一项所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤四中，将芽孢杆菌样品用直径5mm钢珠在30HZ的频率下破碎10分钟。
7.如权利要求2所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤五中，所述蛋白洗脱液由以下方法制得：将0.5mol/L Na2HPO4 57.7ml与0.5mol/LNaH2PO442.3ml混合后用蒸馏水定容至1000ml，再加入0.15mol/L的NaCl，即可配置成蛋白洗脱液。
【技术特征摘要】
1.一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，还包括步骤五：
3.如权利要求2所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤一为：
4.如权利要求3所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤二为：
5.如权利要求4所述的一种从芽孢杆菌中提取漆酶的方法，其特征是，所述步骤三为：
6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡亚君，高骏，陈亚平，齐杭杭，江莹，胡莹玥，
申请(专利权)人：武汉纺织大学，
类型：发明
国别省市：
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