一种定点标记免疫试剂的方法、标记免疫试剂及应用技术

本发明专利技术涉及一种定点标记免疫试剂的方法、标记免疫试剂及应用，该方法首先在抗体或抗原末端连接多肽片段Leu‑Pro‑X‑Thr‑Gly，再在信号分子上连接末端含有至少3个甘氨酸的多肽片段，最后将改造抗体或抗原、改造信号分子及转肽酶Sortase A混合反应，使信号分子定量定点标记到抗原或抗体上，反应中还加入多羟基化合物作为蛋白保护剂，可有效保护抗原或抗体的活性，有效避免转肽酶SortaseA导致的抗原或抗体亲和力受损、稳定性受损等，极大改善了标记免疫试剂的热稳定性和特异性，制备的标记免疫试剂批间差异小，将其应用于免疫分析时还可极大节约抗原或抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种定点标记免疫试剂的方法、标记免疫试剂及应用
本专利技术涉及一种定点标记免疫试剂的方法、标记免疫试剂及应用，属于标记免疫测定

技术介绍
临床免疫测定技术最早出现可追溯至19世纪末，免疫沉淀和免疫凝集技术为经典的免疫测定技术，在此基础上发展出来的标记免疫测定技术可以解决许多经典的免疫测定技术所不能解决的临床测定问题。自从标记免疫测定技术发展以来，发现和应用新的标记物以提高免疫测定的灵敏度、特异性、稳定性和简便性一直是标记免疫测定技术的主要研究方向之一，目前的标记物有同位素、酶、荧光素、胶体金、发光分子等信号分子。标记免疫试剂通常由信号分子标记抗体/抗原而成，传统的标记技术是利用抗原或抗体具有的赖氨酸残基与各种活化形式的信号分子反应，而由于抗原或抗体的赖氨酸残基数量繁多(据统计，150kDa的抗体有超过100个赖氨酸残基)，标记具有随意性，标记物种类、反应温度、投料比、反应体系大小、反应时间、搅拌等因素都会影响标记效果，信号分子标记抗体/抗原的数量和位点均不能很好地控制，过多的信号分子标记到抗原/抗体上会导致其亲和力受损、稳定性受损等，信号分子标记到抗原/抗体的关键位点(如抗原决定簇)会直接导致抗原/抗体失活，不恰当的位置标记还会引起抗原/抗体物理性能(如疏水性)的改变，导致抗原/抗体标记信号分子后完全不可用，因此，优化标记过程以控制信号分子标记免疫试剂的数量和位点，并保持抗原或抗体的活性，避免抗原或抗体亲和力受损、稳定性受损等，这对标记免疫试剂的表现至关重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为解决现有技术存在的上述技术问题以控制信号分子标记免疫试剂的数量和位点，并保持抗原或抗体的活性，避免抗原或抗体亲和力受损、稳定性受损等，提供一种定点标记免疫试剂的方法、标记免疫试剂及应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定点标记免疫试剂的方法，包括如下步骤：在抗体或抗原末端连接含5个氨基酸的多肽片段Leu-Pro-X-Thr-Gly(Leu为亮氨酸，Pro为脯氨酸，X为任意氨基酸，Thr为苏氨酸，Gly为甘氨酸)，得改造抗体或抗原；在信号分子上连接末端至少含3个甘氨酸的多肽片段，得改造信号分子；将改造抗体或抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA及多羟基化合物加入pH为6.0～8.0的缓冲液中，在30-45℃的温度下混合反应1-2h，将信号分子连接到抗原或抗体上；所述信号分子为生物素、吖碇酯或吖啶磺酰胺；优选地，所述缓冲液为PB缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L。优选地，所述改造抗体或抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA及多羟基化合物按0.1-5mol:1-100mol:0.01-0.5g:0.045-1g的比例进行反应。优选地，所述多羟基化合物为聚乙二醇与多糖的混合物，所述聚乙二醇与多糖的质量比为1:0.5-2。优选地，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000、PEG8000中的至少一种，所述多糖为果糖、蔗糖、海藻糖中的至少一种。优选地，所述含5个氨基酸的多肽片段Leu-Pro-X-Thr-Gly连接到抗体Fc末端。优选地，所述信号分子连接末端至少含有3个甘氨酸的多肽片段的方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的信号分子溶于有机溶剂中，得活化的信号分子溶液；于活化的信号分子溶液中加入碱性溶液调至pH为8-9，室温反应2-3小时；加入酸性溶液调至pH为6.5-7.5，再加入sulfo-SMCC，室温反应1-2小时；加入碱性溶液调至pH为8-9，加入末端至少含3个甘氨酸的多肽序列，室温反应8-16小时。优选地，所述碱性溶液为有机胺溶液，所述有机胺为乙二胺、三乙胺、三乙烯二胺、二乙醇胺、三乙醇胺、四甲基乙二胺中的任意一种。优选地，所述酸性溶液为有机酸溶液，所述有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、辛酸、己二酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊酸、己酸、癸酸、丙烯酸中的任意一种。优选地，所述末端至少含3个甘氨酸的多肽序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys(Cys为半胱氨酸)。本专利技术还提供一种通过上述定点标记免疫试剂的方法获得的标记免疫试剂，所述标记免疫试剂为抗原或抗体与信号分子定点结合的结合物，所述信号分子为生物素、吖碇酯或吖啶磺酰胺。本专利技术还提供一种通过上述定点标记免疫试剂的方法获得的标记免疫试剂在标记免疫测定技术的应用。本专利技术的有益效果是：本申请提供了一种新颖高效的方法以将信号分子定点标记抗原或抗体，首先在抗体或抗原末端连接含5个氨基酸的多肽片段Leu-Pro-X-Thr-Gly，再在信号分子上通过特定方法连接末端至少含有3个甘氨酸的多肽片段，最后将改造抗体或抗原、改造信号分子及转肽酶SortaseA混合反应，使信号分子定量定点标记到抗原或抗体上，值得一提的是，反应中还加入多羟基化合物作为蛋白保护剂，可有效保护抗原或抗体的活性，有效避免转肽酶SortaseA导致的抗原或抗体亲和力受损、稳定性受损等，极大改善了标记免疫试剂的热稳定性和特异性，且采用该方法制备的标记免疫试剂批间差异小，极大地减少了企业生产试剂时为筛选合格标记批次而带来的人力物力财力的浪费，将其应用于免疫分析时还可极大节约抗原或抗体。具体实施方式现在对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1本实施例提供一种吖啶酯定点标记人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原的方法获得吖啶酯标记的HIV抗原，具体步骤为：在HIV抗原的末端克隆进带Leu-Pro-Ala-Thr-Gly(Ala为丙氨酸)的表达质粒，将表达质粒转染大肠杆菌后表达，即可在HIV抗原末端连接多肽片段Leu-Pro-Ala-Thr-Gly，得改造HIV抗原；将N-羟基琥珀酰亚胺活化的吖碇酯用DMF溶解，得吖啶酯溶液；于吖啶酯溶液中加入乙二胺溶液调至pH为8-9，室温反应3小时；加入乙酸溶液调至pH为6.5-7.5，再加入sulfo-SMCC，室温反应2小时；加入乙二胺溶液调至pH为8-9，加入多肽序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys，室温反应16小时，得改造信号分子；将改造HIV抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA、PEG4000及果糖加入50mM，pH为6.0的PB缓冲液中，使改造HIV抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA、PEG4000及果糖的浓度分别为5μmol/L、100μmol/L、0.5μg/L、0.5μg/L、0.5μg/L，在50rpm的摇床里，45℃的温度下混合反应1h，将信号分子连接到HIV抗原上，即得标记免疫试剂溶液；将标记免疫试剂溶液移至透析袋(截留分子量8000-12000)，采用0.05mol/LpH为9.5CB缓冲液透析2次，每次透析3小时，加入等量甘油，放置-20℃以下保存。实施例2本实施例提供一种吖啶磺酰胺定点标记HIV抗原的方法获得吖啶磺酰胺标记的HIV抗原，具体步骤为：在HIV抗原的末端克隆进带Leu-Pro-Cys-Thr-Gly的表达质粒，将表达质粒转染大肠杆菌后表达，即可在HIV抗原末端连接多肽片段Leu-Pro-Cys-Thr-Gly，得改造HIV抗原；将N-羟基琥珀酰亚胺活化的吖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定点标记免疫试剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：在抗体或抗原末端连接含5个氨基酸的多肽片段Leu‑Pro‑X‑Thr‑Gly，得改造抗体或抗原；在信号分子上连接末端至少含3个甘氨酸的多肽片段，得改造信号分子；将改造抗体或抗原、改造信号分子、转肽酶Sortase A及多羟基化合物加入pH为6.0～8.0的缓冲液中，在30‑45℃的温度下混合反应1‑2h，将信号分子连接到抗原或抗体上；所述信号分子为生物素、吖碇酯或吖啶磺酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种定点标记免疫试剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：在抗体或抗原末端连接含5个氨基酸的多肽片段Leu-Pro-X-Thr-Gly，得改造抗体或抗原；在信号分子上连接末端至少含3个甘氨酸的多肽片段，得改造信号分子；将改造抗体或抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA及多羟基化合物加入pH为6.0～8.0的缓冲液中，在30-45℃的温度下混合反应1-2h，将信号分子连接到抗原或抗体上；所述信号分子为生物素、吖碇酯或吖啶磺酰胺。2.根据权利要求1所述的定点标记免疫试剂的方法，其特征在于，所述缓冲液为PB缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L。3.根据权利要求1或2所述的定点标记免疫试剂的方法，其特征在于，所述改造抗体或抗原、改造信号分子、转肽酶SortaseA及多羟基化合物按0.1-5mol:1-100mol:0.01-0.5g:0.045-1g的比例进行反应。4.根据权利要求1-3任一项所述的定点标记免疫试剂的方法，其特征在于，所述多羟基化合物为聚乙二醇与多糖的混合物，所述聚乙二醇与多糖的质量比为1:0.5-2，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000、PEG8000中的至少一种，所述多糖为果糖、蔗糖、海藻糖中的至少一种。5.根据权利要求1-4任一项所述的定点标记免疫试剂的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡庆锋，李勇，高炜晰，
申请(专利权)人：苏州立禾生物医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32