一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用制造技术

本发明专利技术属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用。本发明专利技术的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)对常见畜禽肠道致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和魏氏梭菌具有明显的抑菌效果。本发明专利技术包括地衣芽孢杆菌菌株的分离鉴定、生物学特性研究及其作为畜禽饲料添加剂的应用等。本发明专利技术的菌株产纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶，耐受胃酸低pH值及肠道胆盐高渗透压，生长速度快，抗逆性能强，抑菌性较强、产酶能力强的特点，可用于制备畜禽饲用微生物添加剂。

【技术实现步骤摘要】
一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用
本专利技术属于农业微生物学
，具体涉及一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用，所述的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)对常见肠道致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及魏氏梭菌具有明显的抑菌效果。本专利技术包括地衣芽孢杆菌菌株的分离鉴定、生物学特性研究及其作为畜禽饲料添加剂的应用。
技术介绍
抗生素饲料添加剂的使用曾被认为是二十世纪畜牧业生产最伟大的生物技术之一，在防治动物疾病、提高畜禽生产效率，满足人类动物产品需要上发挥了巨大作用。但随着时间的推移，由于饲料中长期添加抗生素带来了许多负面效应，如细菌耐药性和药物残留等，严重危害养殖业健康发展，影响人类食品安全，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。欧盟于2006年已全面禁止在饲料中使用抗生素作为饲料生长添加剂，美国、日本相继跟进；2011年7月1日韩国全面禁止在动物饲料中添加抗生素；近年来我国也不断加强饲添抗生素的管制，禁用饲添抗生素的呼声越来越高。因此研发绿色、无污染、无残留的抗生素替代品及替代技术已成为热点。研究表明，益生菌制剂具有抗菌、抑菌，防止动物疾病，增强动物免疫力，改善动物生产性能的特点，且具有天然、安全、无残留、无污染等优点，能够很好的替代抗生素的抑菌作用；酶制剂同样具有安全、无残留、无污染等优点，能够显著提高饲料转化率，促进动物生长，能够替代抗生素的促生长作用，因此二者均作为饲添抗生素替代品被广泛研究开发与应用。尽管如此，二者均具有较大的局限性，益生菌作用侧重于抗菌、抑菌，促生长效果较弱，而酶制剂作用在于提高饲料转化率，促进动物生长，不具有抗菌效果，且其抗逆性较差，性质不稳定，容易失活。因此研究开发既具有抗菌、抑菌作用，又具有较好的促生长效果高产复合酶的益生菌，将能够很好克服单一益生菌与酶制剂的局限性与缺陷，发挥益生菌与酶制剂的协同效应，且能够有效降低动物生产成本，替代饲添抗生素，为我国畜牧业的绿色、健康可持续发展提供技术支撑。基于以上的论述，本专利技术通过筛选具有良好益生特性及产酶特性的高抗逆性地衣芽孢杆菌，验证其应用效果，为开发具有自主知识产权的新型、高效动物微生态制剂奠定了基础同时也为饲添抗生素的替代产品提供相应的技术和产品支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改善单一益生菌促生长效果较差，酶制剂制备成本高、性质不稳定、易受体内外环境影响等缺点，提供一种高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用。本专利技术通过抑菌性试验、生长曲线以及抗逆性试验等方法筛选出抑菌性较好、繁殖速度快、耐受性强且性质稳定的益生地衣芽孢杆菌菌株。对筛选出的菌株在不同饲料底物培养下的产酶情况进行了系统研究，通过体外消化试验测定其对于不同饲料组合中多糖和蛋白质的降解能力，探索该益生地衣芽孢杆菌对于动物营养吸收的促进作用，为产酶益生素制备和应用提供科学支撑，同时为减少抗生素的使用，提高动物生产性能，减少对环境污染，为发展新型、健康生态养殖模式提供技术支撑。本专利技术的技术方案如下：根据地衣芽孢杆菌的生理生化特性及遗传学特性，与现代分子生物学技术相结合，以采集的健康鸡粪作为菌种来源，选育出一株高产复合酶的地衣芽孢杆菌菌株，申请人将其命名为地衣芽孢杆菌HDRaBLp，BacillusLicheniformisHDRaBLp，于2016年5月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2016300。地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)HDRaBLp的微生物菌学特征：地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)HDRaBLp菌株为革兰氏阳性菌，呈长杆状，单个、成对或链状排列。在LB培养基上生长良好，24h内形成扁平、边缘不整齐的污白色菌落且表面粗糙皱褶。厌氧环境能够生长，明胶液化、M.R、V.P、精氨酸阳性。鸟氨酸、赖氨酸阴性。对其16SrRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blastn比较，发现其16SrRNA与地衣芽孢杆菌(KX812811.1)的序列同源性最高，相似性为99％。本专利技术的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株能耐受10％NaCl、0.5％胆盐的生长环境，在pH2.0的条件下孵育2h，其活菌数几乎没有下降；且在90℃高温孵化10min后其活菌数也几乎没有下降。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利影响，并且能够经受高温制粒的加工等环境。本专利技术的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株繁殖能力很强，无迟缓期，很快进入对数增长期(0h～6h)，6h后进入稳定期，一直持续到18h，细菌数达到最大，为2.35×109CFU/mL，18h后进入衰退期。本专利技术的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株对常见肠道致病菌(大肠杆菌、金黄色萄萄球菌、魏氏梭菌等)均具有明显的抑菌活性。本专利技术的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株具有较强的产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶能力。本专利技术的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株对于饲料营养的消化吸收一定的促进作用，适合作为饲料添加剂添加至饲料中。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术分离的地衣芽孢杆菌HDRaBLp来源于家禽肠道，对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌等)具有明显的抑菌效果，为替代抗生素作为饲料添加剂提供了有力依据。(2)本专利技术分离的菌株生长繁殖速度快，适合于工业化生产；(3)本专利技术分离的菌株能形成芽孢，因而对外界环境有很强的抵抗力，加热至90℃，10min不会失去活性，可完全耐受畜禽体内胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，相比于酶制剂耐受性强且性质稳定，因此可在肠道定植发挥益生作用；(4)本专利技术分离的菌株作为肠道的定植菌，生产及使用均十分简单，产酶总量随时间推移而不断增加，大大降低了直接饲喂酶制剂所需的成本。(5)本专利技术分离的具有一定的产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等复合酶能力，可提高畜禽肠道的消化酶活性，提高饲料消化率和利用率。体外消化试验证明，该菌株对于饲料营养的消化吸收具有一定的促进作用，可替代抗生素作为畜禽饲料添加剂使用，不仅可以提高畜禽生产性能，而且具有环境友好，对人畜安全的优点。更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。附图说明序列表SEQIDNO：1是本专利技术分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp16SrDNA基因部分序列。图1：本专利技术分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株在LB琼脂平板上的生长状态。图2：本专利技术分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株革兰氏染色显微镜形态(×2000)。图3：本专利技术分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株孔雀绿染色显微镜形态(×2000)。图4：本专利技术分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株16SrRNA基因PCR扩增检测结果。附图标记说明：M：DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：HDRaBLb，泳道3：HDRaBLi；泳道4：HDRaBLk，泳道5：HDRaBL1，泳道6：HDRaBLp(本专利技术菌株)泳道7：HDRaBLq，泳道8：HDRaBLt。图5：本专利技术地衣芽孢杆菌的生长曲线。图6：地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株在不同产酶定性平板上的抑菌试验结果。附图标记说明：图6中的A图：接种在纤维素酶定性平板上地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株的抑菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有高产复合酶的对畜禽肠道致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌有明显抑菌效果的地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus Licheniformis)HDRaBLp，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016300。

【技术特征摘要】
1.一种具有高产复合酶的对畜禽肠道致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌有明显抑菌效果的地衣芽孢杆菌菌株(BacillusLicheniformis)HDRaBLp，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016300。2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，李越，章恺伦，金卉，肖运才，周祖涛，石德时，金秀娥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42