基于硫羟的深共晶溶剂制造技术

本文中报导了一种由摩尔比1:2至1:3的氯化(2‑羟乙基)三甲基铵和二硫苏糖醇和0％至10％的共溶剂组成的深共晶溶剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于硫羟的深共晶溶剂本文中报导了基于硫羟的深共晶溶剂及其用途。专利技术背景深共晶溶剂(Deepeutecticsolvents；DES)是熔点低于100℃的无水溶液。DES以氢键为基础。在DES中，水和有机溶剂的特性组合。大部分DES在适于生物催化的温度为液体。DES比水更疏水，然而在一些情况下，它们不导致疏水性诱导的生物催化剂失活(Gorke,J.等人,Biotechnol.BioprocessE15(2010)40-53)。另外，可以无水产生深共晶溶剂并且因此对水解作用迟钝。离子液体具有与DES相似的特性，但是更难以产生并更有害于环境。蛋白酶已经在DES中显示活性(Zhao,H.等人,J.Mol.Catal.B-Enzym72(2011)163-167)。分选酶A(SrtA)是将蛋白质共价接合至细菌细胞壁的膜结合型酶。SrtA底物上的特定识别基序是LPXTG，由此该酶在苏氨酸残基和甘氨酸残基之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已经显示，在N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.等人,Peptidescience94(2010)385-396)。该反应经硫酯酰基酶中间体推进，通过攻击来自寡甘氨酸的胺亲核体、将肽聚糖共价连接至蛋白质底物并再生SrtA而消散。SrtA可以用来将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白质。用于技术上生物缀合的适用分选酶是有限的。最广泛使用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分选酶A(St.au.SrtA)显示适合技术应用的转化动力学，但具有受限的底物谱，仅识别LPXTG分选酶基序。缺少N端膜锚定基序的金黄色葡萄球菌SrtA(Sa-SrtA)已经用于细胞表面蛋白标记、共价性蛋白质固定和向蛋白质掺入新官能团。对于正交/双标记策略，需要具有新底物谱的分选酶。这对标准分选酶介导的生物缀合方案同样如此，其中产物中的LPXTG基序例如对其结构和/或功能具有不利作用。因此，识别序列与LPXTG不同的分选酶其是有高度价值的。化脓性葡萄球菌SrtA(St.py.SrtA)识别LPXTA分选酶基序，然而在技术规模上，该酶的转化动力学参数令其成为不合适的分选酶。文献中报导了接受与LPXTG不同的分选酶基序的分选酶。其下有野生型，例如来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的分选酶A(St.py.SrtA)和来自艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的分选酶A(Cl.di.SrtA)以及工程化分选酶。除了St.py.SrtA之外，报导的分选酶均不识别LPXTA基序(参见，例如vanLeeuwen,H.C.等人,FEBSLett.588(2014)4325-4333；Dorr,B.M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA111(2014)13343-13348；Bentley,M.L.等人,J.Biol.Chem.282(2007)6571-6581；Race,P.R.等人,J.Biol.Chem.284(2009)6924-33；Antos,J.M.等人,J.Am.Chem.Soc.131(2009)10800-10801)。分选酶反应在具有几个缺点的水溶液中进行。一个缺点是许多化合物在水中具有低溶解度-这对许多荧光团来说尤其如此。另外，分选酶具有很低的Km，从而使疏水性底物不可用于分选酶反应(Chen,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11399-11404)。但是，与荧光团连接的抗体/结合性蛋白质可能是生物缀合过程中最重要的应用(Shreve,P.和Aisen,A.M.,Magneticresonanceinmedicine:officialjournaloftheSocietyofMagneticResonanceinMedicine/SocietyofMagneticResonanceinMedicine3(1986)336-340；Drapkin,R.L.等人,Am.J.Hematol.7(1979)163-172)。另一个问题是反应期间形成的酶中间体。它可以遭水解，这导致产物损耗。这使得无水且有机溶剂成为水的有意义备选。但是，分选酶在有机溶剂中不稳定，例如超过20％的二甲基亚砜(DMSO)削弱分选酶活性(Pritz,S.(2008)EnzymatischeLigationvonPeptiden,undProteinen)。在WO2010/087994中报导了用于连接的方法及其用途。针对IgG样双特异性抗体的重组方法由Marvin,J.S.等人(ActaPharmacol.Sinica26(2005)649-658)报导。在WO2013/003555中，报导了使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学手柄(clickchemistryhandles)。Strijbis,K.等人(Traffic13(2012)780-789)报导在活细胞中使用分选酶连接蛋白质。它们已经宣称Ca2+依赖性金黄色葡萄球菌分选酶A在胞内无功能，但是Ca2+非依赖性酿脓链球菌(S.pyogenes)分选酶A在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和哺乳动物HEK293T细胞的细胞溶胶和内质网(ER)腔中均有功能。Levary,D.A.等人报导由分选酶A催化的蛋白质-蛋白质融合(PLOSONE6(2011))。Madej,M.P.等人报导了将抗表皮生长因子受体抗体工程化成单链样式并通过分选酶A介导的蛋白质连接作用标记(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)。Ta,H.T.等人报导了酶促单链抗体加标签作为心血管疾病中靶向分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.等人报导使用分选酶产生和破坏肽键–蛋白质工程(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。在WO2010/099536中报导了对DOTA螯合物具有高亲和力的工程化蛋白质。已经报导了阻断分选酶逆反应的不同尝试。Yamamura,Y.等人(Chem.Commun.47(2011)4742-4744)报导通过在底物识别位点周围引入β-发夹而在连接位点附近引入β-发夹结构，增强分选酶A介导的蛋白质连接。Biswas,T.等人(Biochem.53(2014)2515-2524)报导了通过原型分选酶A分选LPXTG肽类(不变底物残基调节生产型底物的酶动力学和构象特征标识的作用)。Li,Y.M.等人报导了通过使用分选酶对蛋白质的不可逆性位点特异性肼解(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53(2014)2198-2202)。Ling和合作者显示通过分选酶引入硫酯(Ling,J.J.J.等人,J.Am.Chem.Soc.134(2012)10749-10752)。Lindberg,D.等人(J.Biotechnol.147(2010)169-171)报导深共晶溶剂(DES)是酶催化环氧化物水解的可行共溶剂。Gorke,J.T.等人报导了深共晶溶剂中水解酶催化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.深共晶溶剂，由摩尔比1:2至1:3的氯化(2‑羟乙基)三甲基铵和二硫苏糖醇和多于0％至10％的共溶剂组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.05 EP 16154372.31.深共晶溶剂，由摩尔比1:2至1:3的氯化(2-羟乙基)三甲基铵和二硫苏糖醇和多于0％至10％的共溶剂组成。2.深共晶溶剂，由以下组成a)i)氯化(2-羟乙基)三甲基铵，和ii)4-巯基-1-丁醇或1-巯基-2-丙醇，i)对ii)的摩尔比是约1:2，和b)多于0％至约10％共溶剂。3.深共晶溶剂，由摩尔比约1:1的氯化(2-羟乙基)三甲基铵和2-巯基乙磺酸钠和多于0％至约10％的共溶剂组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的深共晶溶剂，其中共溶剂是含水共溶剂。5.根据权利要求4所述的深共晶溶剂，包含多于0％直至约5％(v/v)的含水共溶剂。6.用于酶促产生多肽的方法，包括以下步骤：-在根据权利要求1至5中任一项所述的深共晶溶剂中温育i)包含氨基酸序列LPXTG(SEQIDNO:01，其中X可以是任何氨基酸残基)或LPXTA(SEQIDNO:101，其中X可以是任何氨基酸残基)的第一多肽，ii)i)在其N端包含甘氨酰、丙氨酰基或半胱氨酰化合物，或ii)在其N端包含寡甘氨酸、或寡丙氨酸、或半胱氨酸氨基酸残基后接一个至三个甘氨酸或丙氨酸氨基酸残基，或iii)在其5个N端氨基酸残基范围内包含赖氨酸氨基酸残基的第二多肽，和iii)具有分选酶A活性的第三多肽，和由此产生多肽。7.根据权利要求6所述的方法，其中第二多肽在其N端具有氨基酸序列GGG、AAA、CGG、CAA、KGG或KAA(SEQIDNO:29、162-16...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·伯尼茨杜拉特，M·沙特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH