酵母细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种Komagataella属酵母细胞，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酵母细胞本专利技术涉及在酵母细胞中的直系同源启动子的用途。诸如生物药物或工业相关生物催化剂的重组蛋白最常通过在微生物中进行异源基因表达的方式生产。经常使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和丝状真菌并长期将其用于重组蛋白的生产。在过去二十年中，甲基营养型酵母Komagataella(Pichia)pastoris、Komagataella(Pichia)phaffii(Pp)、KomagataellaKurtzmanii、Ogataea(Hansenula)polymorpha(Hp)、Candidaboidinii(Cb)和Ogataea(Pichia)methanolica(Pm)已成为有效的替代生产菌株。这些菌株使高细胞密度的异源蛋白实现高速表达成为可能。在上述四个酵母物种中，P.pastoris(Komagataellaphaffii)在此期间最长用于异源蛋白生产。所有甲基营养型酵母均具有严格调控的强启动子，其参与甲醇利用(MUT)基因表达的调控。甲醇利用基因的启动子通常在存在抑制碳源(如葡萄糖)时被抑制，并且在存在甲醇作为碳源时极大地上调。如果抑制碳源被耗竭或在存在非抑制性碳源的条件下，则所述启动子通过解阻遏被活化，因此这种作用的强度在物种之间以及甚至在同一生物体内可能变化极大。例如，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在P.pastorisGS115(PPpAOX1)中醇氧化酶-1基因的启动子仅具有2-4％的活性。而与此相反的是，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在H.polymorpha(PHpMOX)中直系同源物基因(甲醇氧化酶，MOX)的启动子具有高达70％的活性。而且在C.boidinii(醇氧化酶1，AOD1)和P.methanolica(甲醇氧化酶1/2，MOD1/2)中的直系同源物基因的启动子也具有类似的行为。出于操作安全性方面的原因，特别是在大规模工业生产中使用具有毒性和可燃性的甲醇诱导表达的不利的，因此强解阻遏启动子构成了有利的替代方案。因此，最近开发了具有不同解阻遏性质的PPpAOX1变体、替代启动子和新型MUT启动子，以使得能够在工业生产规模上实现无甲醇蛋白表达。由于与甲醇诱导的启动子相比，此类启动子的表达速率通常低很多，因而本专利技术的一个目的是提供重组蛋白在酵母(如P.pastoris)中可诱导的和无甲醇强过表达替代的可能性。使用Komagataella属酵母细胞实现了这一目的，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)或甲醇氧化酶(MOX)启动子；在这一过程中，在甲基营养型酵母细胞中的直系同源启动子能够在解阻遏条件下控制多肽的表达。使用Komagataella(Pichia)属酵母细胞也实现了这一目的，所述细胞包含甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子和/或甲醇氧化酶(MOX)启动子或者这两种启动子的变体，其中在Komagataella属酵母细胞中直系同源启动子的原始调控性质被保留。令人惊讶地发现，在其他甲基营养型酵母细胞中也具有能够在解阻遏条件下控制多肽表达的启动子，其优选地不属于Komagataella(Pichia)属，能够在解阻遏条件下控制多肽的表达(例如，与非解阻遏条件相比表达增加)，其也具有与在Komagataella(Pichia)属酵母细胞中相似的性质。此外，令人惊讶地发现，在Komagataella属酵母细胞中和/或在相同酵母细胞中不天然存在的甲基营养型酵母细胞的甲酸脱氢酶(FMD)启动子和/或甲醇氧化酶(MOX)启动子在此类细胞中具有特定的性质。在解阻遏条件下和在甲醇诱导的条件下在Komagataella细胞中的直系同源FMD和/或MOX启动子均显著强于所有天然存在的启动子，其在Komagataella中参与甲醇利用基因的表达(“MUT启动子”)并且到目前为止已对其进行了检测。因此，在解阻遏条件下直系同源FMD和/或MOX启动子显著强于Komagataella细胞中天然存在的CAT1和GAP启动子，例如。直系同源FMD和/或MOX启动子甚至令人惊讶地与在甲醇诱导条件下在Komagataella中天然存在的AOX(AOX1和AOX2)启动子一样强，且其所使用的筛选条件是在解阻遏条件下，而非在甲醇诱导条件下使用AOX启动子。在生物反应器实验中，在控制C源剂量的条件下通常可以加强这种作用。直系同源FMD和/或MOX启动子可以代替通常在Komagataella中使用的AOX启动子。与传统甲醇诱导的表达系统相比，这种方式可以实现基本相同或者甚至更高的蛋白表达收率，但是不需要使用任何甲醇作为诱导剂。令人惊讶的是，在这种酵母细胞(例如，在H.polymorpha中)也显著解阻遏的甲基营养型酵母细胞的甲酸脱氢酶(FMD)启动子(例如，H.polymorpha的)甚至在其他甲基营养型酵母细胞(例如，P.pastoris)中也保留了这种调控性质。而与之相反的是，早期研究表明，在启动子在甲基营养型酵母之间的转移中，外源启动子的调控性质是不能转移的(例如，P.pastorisAOX1启动子例如在H.polymorpha中没有与其在P.pastoris中天然存在的一样被严格阻遏；参见例如W.C.Raschke等，Gene177(1996):163-167和L.Rodriguez等，Yeast12(1996):815-822)。因此，在该
目前的观点是甲基营养型酵母细胞之间不同类型的调控不会由于启动子序列而产生，而是由于酵母细胞中不同的调控机制产生(参见例如，F.S.Hartner等，Microb.CellFact5(2006):39-59)。然而，令人惊讶地发现，由于解阻遏产生的甲基营养型酵母细胞(例如，H.polymorph)的甲酸脱氢酶(FMD)启动子的强活性不仅能够转移至其他甲基营养型酵母细胞(例如，Komagataellaphaffii)，而且这种替代甚至超过了如AOX1基因和CAT1基因的强同源启动子的技术性质。直系同源启动子序列的使用还具有其他技术优势。例如，通过使用其降低了同源重组的可能性，导致表达菌株具有更高的遗传稳定性。“Komagataella属酵母细胞”包括该属的所有酵母细胞，如Komagataellakurtzmanii、Komaga-taellapastoris、Komagataellaphaffii、Komagataellapopuli、Komagataellapseudopastoris、Komagataellaulmi和Komagataellasp.11-1192。“Komagataella属酵母细胞”当然也包括来自上文所述属的特定菌株的那些，例如，KomagataellapastorisGS115、X-33、KM71、KM71H、CBS7435或NRLLYll430、CBS704、BG10、BG11和/或这些菌株的其他衍生物。如在本申请中所使用的，术语“直系同源”指至少与其他物种相应的核酸和氨基酸分子具有功能同源性的来自不同物种的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Komagataella属酵母细胞，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.22 EP 15202233.11.一种Komagataella属酵母细胞，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子。2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述直系同源启动子是可用甲醇诱导的。3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述直系同源启动子与编码异源或同源多肽的核酸分子可操作地连接。4.根据权利要求3所述的酵母细胞，其中所述异源或同源多肽包含信号肽，特别是分泌信号肽。5.根据权利要求1至4中任意一项所述的酵母细胞，其中所述直系同源启动子来源于选自下组的甲基营养型酵母细胞：汉逊酵母属、假丝酵母属、Komagataella属和毕赤酵母属。6.根据权利要求1至5中任意一项所述的酵母细胞，其中所述甲基营养型酵母细胞选自下组：多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、Komagataellapastoris、Komagataellaphaffii、Komagataellapopuli、Komagataellapseudopastoris、Komagataellaulmi和Komagataellasp.11-1192。7.根据权利要求1至6中任意一项所述的酵母细胞，其中所述直系同源启动子和任选地编码所述异源或同源多肽的所述核酸分子在基因组中，而且可操作地连接的启动子任选地存在于基因组中或作为染色体外核酸构建体存在。8.根据权利要求1至7中任意一项所述的酵母细胞，其中所述直系同源启动子包含核酸序列SEQIDNo.1或其变体。9.根据权利要求8所述的酵母细胞，其中所述SEQIDNo.1的变体包含核酸序列SEQIDNo.27：AATGTATCTAAACGCAAACTCCGAGCTGGAAAAATGTTACCGGCGATGCGCGGACAATTTAGAGGCGGCGAX1TCAAGAAACACCTGCTGGGCGAGCAGTCTGGAGCACAGTCTTCGATGGGCCCGAGATCCCACCGCGTTCCTGGGTACCGGGACGTGAGGCAGCGCGACATCCATCAAATATACCAGGCGCCAACCGAGTCTCTCGGAAAACAGCTTCTGGATATCTTCCGCTGGCGGCGCAACGACGAATAATAGTCCCTGGAGGTGACGGAATATATATGTGTGGAGGGTAAATCTGACAGGGTGTAGCAAAGGTAATATTTTCCTAAAACATGCAATCGGCTGCCCCGCX2ACGGGAAAAAGAATGACTTTGGCACTCTTCACCAGAGTGGGGTGTCCCGCTCGTGTGTGCAAATAGGCTCCCACTGGTCACCCCGGATTTTGCAGAAAAAX3AGCAAGTTCCGGGGTGTCTCACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：T沃格，A戈利埃德，
申请(专利权)人：合成生物制品公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT