一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药(模型药物，如葛根素、黄芩苷等，共性：均可作用于缺血心肌细胞线粒体治疗心肌缺血再灌注损伤)纳米胶束的方法。所述方法包括TPP‑PEG‑PE嵌段共聚物的合成、序级靶向载药纳米胶束的制备。本发明专利技术采用序级靶向纳米胶束将葛根素药物精准递送到缺血心肌细胞线粒体，发挥药理作用。先以PEG‑PE纳米胶束的EPR效应，将药物载体靶向蓄积于梗死早期的缺血心肌；然后以TPP阳离子的电荷效应，介导药物载体进入带负电荷的心肌细胞线粒体，将葛根素等药物逐级靶向到缺血心肌细胞线粒体，实现精准化给药。

A method for constructing mitochondrial drug loaded nanosmicelles in ischemic myocardium at sequential level

The present invention discloses a method for constructing sequence-targeted mitochondrial drug-loaded (model drugs, such as puerarin, baicalin, etc.) nanomicelles for treating myocardial ischemia-reperfusion injury by acting on ischemic myocardial mitochondria. The method comprises the synthesis of TPP PEG PE block copolymer and the preparation of order-directed drug-loaded nanomicelles. The sequential targeting nanomicelles are used to deliver puerarin drugs precisely to the mitochondria of ischemic cardiomyocytes and play a pharmacological role. The EPR effect of PEG PE nanomicelles was used to accumulate drug carriers in ischemic myocardium at the early stage of infarction, and then the charge effect of TPP cations was used to induce drug carriers to enter the negative charged cardiomyocyte mitochondria. Puerarin and other drugs were targeted to the ischemic myocardial mitochondria step by step to achieve precise drug delivery.

【技术实现步骤摘要】
一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法
本专利技术属于药物制剂领域，具体涉及一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法。
技术介绍
急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction,AMI)是临床上常见的可导致病人猝死的急危重症。冠状动脉介入术恢复冠脉血流是目前临床上挽救AMI病人的常用治疗方法，但随之引起的心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)损伤，可促使缺血心肌梗死面积增加20％-50％，目前尚无很好的解决办法。心肌I/R损伤机制主要表现为线粒体功能障碍，及其诱导的心肌细胞凋亡和自噬，恢复线粒体的正常功能对于减轻心肌I/R损伤无疑具有重大科学研究价值。目前临床上治疗心肌I/R损伤的大部分药物缺乏组织特异性，对心肌细胞选择性不强，到达线粒体效应靶点的浓度很低，导致药物的预期疗效不理想。因此，实现药物靶向缺血心肌细胞线粒体具有非常重要的临床意义。(1)心肌I/R损伤与线粒体mPTP开放密切相关线粒体功能障碍与心肌I/R损伤的各个环节都密切相关，尤其是心肌细胞凋亡和自噬。生理状态下，线粒体膜上的通透性转换孔(Mitochondrialpermeabilitytransitionpore，mPTP)呈关闭状态，在心肌I/R早期，线粒体偏离生理平衡点，产生大量超氧化物阴离子和活性氧，导致线粒体钙超载和氧化应激增加，线粒体膜、酶、电子传递链发生氧化损伤，产生ATP减少，促使线粒体膜上的mPTP开放，引起线粒体内膜通透性急剧增加，使得细胞色素C(CytochromeC，CytC)从线粒体内释放入胞浆，触发Caspases的级联效应，导致凋亡相关蛋白Bcl-2(抗凋亡)表达降低、Bax(促凋亡)表达升高，从而诱导心肌细胞凋亡；还可以激活Beclin1介导的自噬，表现为细胞内出现大量自噬体和自噬溶酶体，最终细胞被自身溶酶体降解，引发自噬性细胞死亡。因此，在再灌注早期有效地抑制线粒体mPTP的开放，减少心肌细胞凋亡和自噬，可作为心肌I/R损伤新的治疗策略。(2)模型药物-葛根素具有抑制线粒体mPTP开放的作用葛根素是从中药葛根中提取的有效成分，具有扩张冠状动脉、改善冠脉循环、减少心肌I/R损伤和抑制血小板聚集等多种药理作用，临床上常采用葛根素注射液治疗冠心病、心绞痛和心肌梗死等疾病。目前通过对葛根素减少心肌I/R损伤的机制研究发现，葛根素可以抑制线粒体mPTP的开放，调节线粒体的生理功能。GaoQ和YaoH等研究发现葛根素保护I/R损伤心肌的作用与促进mitoKATP通道和mitoKCa通道的开放，进而稳定线粒体膜电位，抑制mPTP开放有关。以上文献报道表明：葛根素通过抑制mPTP的开放，维持线粒体稳态平衡，抑制心肌细胞凋亡和自噬，增加线粒体对缺血的耐受性，从而减少心肌I/R损伤，故推测将药物传递到位于线粒体的效应靶点，实现精准化给药，将有可能很大程度上提高药物治疗效果、减少给药剂量。将葛根素药物传递到线粒体需要克服多层生物学屏障：首先，葛根素药物载体必须富集在缺血心肌部位；其次，药物载体需克服肝脾网状内皮系统(RES)的捕获，确保药物在到达靶器官时能够维持有效浓度；最后，细胞液呈高粘度状态，阻碍线粒体摄取药物，同时细胞内溶酶体还能够降解药物，进一步降低到达效应细胞器的药物浓度。所有这些问题都与构建高效的线粒体靶向递药系统密切相关，值得深入探讨和系统研究。(3)PEG-PE纳米胶束可以被动渗透富集在缺血心肌部位，还可减少药物被RES捕获线粒体靶向给药系统可以很大程度上提高药物的治疗效果，该方面的研究报道主要见于肿瘤药物。如ZhangC课题组构建了一种源头创新的线粒体靶向系统，为线粒体靶点抗肿瘤药物提供了安全、高效的载体平台，构建类似功能的缺血心肌细胞线粒体靶向给药系统，这可能是一个全新的、具有挑战性的研究领域。线粒体在体内组织细胞中均有分布，如何将药物聚集在缺血心肌部位为实现心肌细胞线粒体靶向给药的前提。据文献报道，缺血心肌区域血管内膜通透性异常升高，PEG高分子在缺血心肌部位具有较好的高通透性和滞留效应(Enhancedpermeabilityandretentioneffect,EPR)。正常组织血管壁细胞排列紧密，且结构完整，故PEG高分子载药系统随血液循环过程中几乎不会渗出，但在心肌缺血区域PEG高分子能透过通透性增加的血管内膜，汇集于梗死早期心肌组织。我们的前期研究结果发现：PEG化葛根素在急性心肌缺血模型大鼠心肌组织中的AUC为正常大鼠的1.7倍，具有明显的缺血心肌靶向性；葛根素PEG-PE纳米胶束在急性缺血模型小鼠心脏中的AUC为正常小鼠心脏中的1.9倍，表明葛根素PEG-PE纳米胶束在心肌梗死早期区域具有较好的心脏靶向性，可以将药物蓄积于缺血心肌。LukyanovAN等也发现聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)纳米胶束主要聚集梗死早期心肌组织，其含量为未梗死区心肌的8倍。前期研究和文献报道支持PEG高分子和PEG-PE纳米胶束在缺血心肌部位具有较好的EPR效应，可以将药物被动蓄积于心脏的病变部位，提高药物的选择性。另外，PEG-PE纳米胶束外围的PEG高分子具有良好的生物相容性，且纳米胶束粒径很小，可以减少肝脾网状内皮系统(RES)的捕获。(4)TPP阳离子可介导药物载体靶向进入线粒体，并减少药物被溶酶体降解载药胶束滞留于缺血心肌部位后，如何克服细胞液的阻挡和溶酶体的破坏，为实现药物线粒体靶向的关键问题。目前大量研究证实Triphenylphosphonium(TPP)阳离子具有线粒体靶向性，由于线粒体内膜带150-180mv负电荷，细胞膜带30-60mv负电荷，而TPP为三苯基膦阳离子带正电荷，正负电荷相互吸引，促使TPP阳离子聚集于线粒体的能力提高100-500倍，能够克服高粘度细胞液的阻碍。文献报道TPP阳离子可介导肿瘤药物、抗氧化药物和G(5)-PAMAM树枝状嵌段共聚物靶向进入线粒体，由此类推，TPP阳离子同样可作为载药纳米胶束递送于心肌细胞线粒体的主动靶向分子；另外，TPP阳离子在溶酶体具有“质子海绵”效应，可以减少细胞内溶酶体和内涵体对纳米胶束的破坏，起到“溶酶体逃逸”效果，进一步提高药物在效应细胞器中的浓度。经检索国内外文献，查阅到透明质酸修饰的葛根素PEG-PLGA纳米粒，葛根素PEG-PE纳米胶束以及PEG化葛根素等报道，内容主要涉及纳米材料体外缓慢释放药物、降低红细胞溶血、对缺血再灌注心肌的保护作用、抗细胞凋亡以及在急性心肌缺血动物体内的组织分布等，构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体的载药纳米胶束需克服诸多技术瓶颈，本专利技术鉴于PEG-PE高分子在缺血心肌部位的EPR效应，再加上TPP阳离子的电荷效应，逐步将葛根素等药物递送到缺血心肌细胞线粒体效应部位，抑制线粒体膜上的通透性转换孔开放，从而减少缺血再灌注期心肌细胞大量凋亡和自噬，与以往的葛根素纳米药物相比，精准递送药物至效应细胞器的作用靶点，不仅很大程度上提高药物的作用效果，还可以减少药物的不良反应。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述构建序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法，所述方法包括如下步骤：(1)合成TPP‑PEG‑PE嵌段共聚物：将CTPP溶于氯仿，然后加入三乙胺、NHS和EDC，5—30℃下搅拌后再加入DSPE‑PEG‑NH2的氯仿溶液，在氮气或氩气等惰性气体的保护下，5—30℃搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤后离心(或者透析袋除去小分子物质)，取下层沉淀物，再将下层沉淀物冷冻干燥，得TPP‑PEG‑PE嵌段共聚物；所述TPP‑PEG‑PE嵌段共聚物结构式如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法，所述方法包括如下步骤：(1)合成TPP-PEG-PE嵌段共聚物：将CTPP溶于氯仿，然后加入三乙胺、NHS和EDC，5—30℃下搅拌后再加入DSPE-PEG-NH2的氯仿溶液，在氮气或氩气等惰性气体的保护下，5—30℃搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤后离心(或者透析袋除去小分子物质)，取下层沉淀物，再将下层沉淀物冷冻干燥，得TPP-PEG-PE嵌段共聚物；所述TPP-PEG-PE嵌段共聚物结构式如式Ⅰ所示：(2)制备序级靶向载药纳米胶束：将PEG-PE、TPP-PEG-PE与药物共溶于有机溶剂中，采用薄膜水化法即可制备序级靶向载药纳米胶束；所述药物为具有调节缺血心肌细胞线粒体功能治疗心肌缺血再灌注损伤的药物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载葛根素的序级靶向纳米胶束的平均粒径为10—100nm，呈良好的正态分布，zeta电势为-20—+20mV。3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新义，向大雄，李文群，罗世林，杨永玉，李健和，胡雄彬，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43