本发明专利技术提供了一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统。该递药系统为聚合物胶束，由嵌段共聚物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸自组装得到，同时合成线粒体靶向阿霉素-三苯基膦复合物(TPP-DOX)，并将阿霉素与阿霉素-三苯基膦(DOX/TPP-DOX)共同包裹于聚合物胶束中得到载药胶束。此递药系统可发挥主动靶向作用并具有酸敏特性，进入肿瘤细胞后可将阿霉素同时定位释放于线粒体和细胞核，增强抗肿瘤活性，并逆转肿瘤耐药，为突破化疗药物易产生耐药性的困境提供新策略。
【技术实现步骤摘要】
一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统
本专利技术涉及一种兼具肿瘤主动靶向、线粒体定位及逆转肿瘤耐药功能的胶束递药系统的处方组成及应用方案，此递药系统为包裹阿霉素/阿霉素-三苯基膦复合物(DOX/TPP-DOX)的叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸胶束。
技术介绍
肿瘤发病率逐年上升，致死率极高，严重威胁人类健康。化疗是肿瘤的常用治疗手段，阿霉素(DOX)为一线化疗药物，疗效确切、价格低廉，但阿霉素对正常组织的毒副作用及易耐药的特点限制了其临床应用。肿瘤产生多药耐药是化疗失败的首要原因。阿霉素的主要作用靶点为细胞核，若肿瘤细胞产生耐药性，阿霉素在到达作用靶点前被泵出细胞而失活。因此，找寻其它作用靶点，提高阿霉素在胞内的有效浓度是逆转耐药的手段之一。研究发现阿霉素可分作用于线粒体，引起细胞凋亡。因此，设计线粒体靶向的阿霉素复合物或递药系统可逆转耐药。阳离子脂质化合物(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)对线粒体具有很高的亲和力，若将TPP与DOX或载体材料连接可得到线粒体靶向的TPP-DOX连接物，从而改变DOX的胞内分布，并逆转耐药。但是游离TPP-DOX在体内无肿瘤靶向性，需将其装载于递药系统中，才能实现肿瘤细胞线粒体靶向。聚合物胶束是由两亲性嵌段共聚物在水中自组装形成的一种热力学稳定的胶体溶液，多为核-壳结构，可提高难溶性药物溶解度、保护被包裹药物，且具有肿瘤靶向性和缓释特性。许多肿瘤细胞表面叶酸受体高表达，而且肿瘤细胞内溶酶体环境呈酸性。因此，将DOX和TPP-DOX同时包封于修饰有叶酸的酸敏胶束中，构建兼具肿瘤主动靶向和逆转耐药功能的新型递药系统，增加阿霉素在肿瘤细胞的细胞核和线粒体的富集，降低其在正常组织的分布，逆转耐药，得到高效低毒的新型肿瘤靶向递药系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统，兼具肿瘤主动靶向、线粒体定位及逆转肿瘤耐药功能。通过递药系统的设计，可提高阿霉素在肿瘤细胞的细胞核和线粒体有效浓度，降低药物在正常组织的分布，逆转耐药，从而得到高效、低毒、逆转耐药的递药系统，为抗肿瘤药物开发提供新思路。本专利技术的技术方案是：一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统，其特征是由嵌段化合物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸(FA-PEG-PASP)同时包裹阿霉素(DOX)和阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)，自组装得到聚合物纳米胶束，其中(1)叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA-PEG-hyd-PASP)的制备方法是：将叶酸溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，上述反应液在氮气保护下室温反应12h，随后将其滴入H2N-PEG-NH2的DMSO溶液中，混合液继续室温反应2h，反应结束后，加入5倍反应液量的水，过滤，滤液置于透析膜(MW1000Da)中透析3天，冻干即得叶酸-聚乙二醇-NH2(FA-PEG-NH2)；将对乙酰基苯甲酸，NHS，EDCI依次加入DMSO中充分溶解，混合液室温搅拌反应5h后加入FA-PEG-NH2，室温条件下氮气保护反应过夜；反应结束后，加入10倍反应液量的水，并置于透析膜(MW1000Da)中透析3天，冻干即得叶酸-聚乙二醇-对乙酰氨基酸(FA-PEG-ABA)；称取适量聚天冬氨酸溶于DMSO中，加入10％的水合肼，室温搅拌2h后，加入FA-PEG-ABA，室温继续反应24h，反应结束后，加入10倍反应液量的水，并置于透析膜(MW8000Da)中透析3天，冻干即得具有酸敏特性的叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA-PEG-hyd-PASP)；(2)阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)的制备方法是：称取(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)、NHS、EDCI溶于二氯甲烷中，另将适量阿霉素(DOX)溶于二氯甲烷中，三乙胺处理后将DOX二氯甲烷溶液缓慢滴加至TPP反应液中，室温搅拌反应24h，目标产物通过硅胶柱层析纯化即得TPP-DOX；(3)FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束的制备方法是：称取适量的FA-PEG-hyd-PASP聚合物溶于DMSO中，加入DOX和TPP-DOX(W/W，1:1)，室温搅拌4h后，加入10倍量的去离子水，置于透析袋(MW35000Da)中透析2天，收集透析液，冻干即得载DOX/TPP-DOX的FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束。本专利技术构建了一种新型纳米递药系统，此递药系统为聚合物纳米胶束，胶束材料为叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸连接物(FA-PEG-hyd-PASP)，包裹阿霉素(DOX)与阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)得载药胶束。该胶束可发挥主动靶向作用，递送更多的药物至叶酸高表达肿瘤细胞。进入肿瘤细胞后，根据线粒体/溶酶体微环境偏酸的特性(pH＝5)，呈酸敏特性的聚合物胶束可释放出包裹药物，使具有线粒体靶向作用的TPP-DOX到达线粒体，逆转肿瘤耐药。附图说明图1是共同包封DOX/TPP-DOX的FA-PEG-hyd-PASP聚合物胶束在不同pH溶液中的DOX和TPP-DOX释药曲线图，其中n＝3。图2是载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束在KB细胞(A)、A549细胞(B)、Hela细胞(C)和MDA-MB-231/ADR细胞(D)上的细胞毒性。其中n＝6，##P<0.01vs载DOX胶束组，**P<0.01vs载TPP-DOX胶束组。图3是DOX(E)和载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束(F)在MDA-MB-231/ADR细胞中的摄取和定位示意图。图4是DOX和载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束对荷瘤裸鼠(移植耐药细胞MDA-MB-231/ADR)肿瘤生长的抑制作用。图5是荷瘤裸鼠静脉注射给予DOX和载药(DOX/TPP-DOX)FA-PEG-hyd-PASP胶束后，阿霉素(DOX)在裸鼠体内的分布图。具体实施方式阿霉素肿瘤靶向递药系统的制备及抗肿瘤活性研究1目的：评价包裹DOX/DOX-TPP的聚合物胶束的抗肿瘤活性。2研究方法：2.1包封率及载药量测定将胶束溶于DMSO中，破坏胶束结构，HPLC-MS/MS法检测包封率和载药量。载药量＝(递药系统中包裹的药物量/载药递药系统重量)×100％包封率＝(实际载药量/投药量)×100％2.2酸敏特性评价称取适量载药胶束溶于不同释药介质，置于透析袋内，于设定时间点下取样，通过HPLC-MS/MS测定不同pH下(pH5.0,pH6.5和pH7.4)递药系统的释药情况。2.3细胞毒性评价分别培养人肺癌A549细胞、人口腔表皮样癌KB细胞、肝癌HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞、耐阿霉素乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数生长期细胞接种于96孔板中，密度为1×104，培养24h后分别加入阿霉素及各载药胶束，不含血清的培养液设为空白对照组，48h后加入20μLMTT继续孵育4h，弃去培养液，用150μLDMSO重新溶解紫色结晶，酶标仪于490nm下读取OD值，绘制细胞存活率曲线图，按公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(试验组OD值/空白对照组OD值)×1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统，其特征是由嵌段化合物叶酸‑聚乙二醇‑聚天冬氨酸(FA‑PEG‑PASP)同时包裹阿霉素(DOX)和阿霉素‑三苯基膦(TPP‑DOX)，自组装得到聚合物纳米胶束，其中(1)叶酸‑聚乙二醇‑聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA‑PEG‑hyd‑PASP)的制备方法是：将叶酸溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入NHS(N‑羟基琥珀酰亚胺)和EDCI(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺)，上述反应液在氮气保护下室温反应12h，随后将其滴入H2N‑PEG‑NH2的DMSO溶液中，混合液继续室温反应2h，反应结束后，加入5倍反应液量的水，过滤，滤液置于透析膜(MW 1000 Da)中透析3天，冻干即得叶酸‑聚乙二醇‑NH2(FA‑PEG‑NH2)；将对乙酰基苯甲酸，NHS，EDCI依次加入DMSO中充分溶解，混合液室温搅拌反应5h后加入FA‑PEG‑NH2，室温条件下氮气保护反应过夜；反应结束后，加入10倍反应液量的水，并置于透析膜(MW 1000 Da)中透析3天，冻干即得叶酸‑聚乙二醇‑对乙酰氨基酸(FA‑PEG‑ABA)；称取适量聚天冬氨酸溶于DMSO中，加入10％的水合肼，室温搅拌2h后，加入FA‑PEG‑ABA，室温继续反应24h，反应结束后，加入10倍反应液量的水，并置于透析膜(MW 8000 Da)中透析3天，冻干即得具有酸敏特性的叶酸‑聚乙二醇‑聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA‑PEG‑hyd‑PASP)；(2)阿霉素‑三苯基膦(TPP‑DOX)的制备方法是：称取(3‑丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)、NHS、EDCI溶于二氯甲烷中，另将适量阿霉素(DOX)溶于二氯甲烷中，三乙胺处理后将DOX二氯甲烷溶液缓慢滴加至TPP反应液中，室温搅拌反应24h，目标产物通过硅胶柱层析纯化即得TPP‑DOX；(3)FA‑PEG‑hyd‑PASP聚合物胶束的制备方法是：称取适量的FA‑PEG‑hyd‑PASP聚合物溶于DMSO中，加入DOX和TPP‑DOX(W/W，1:1)，室温搅拌4h后，加入10倍量的去离子水，置于透析袋(MW 35000 Da)中透析2天，收集透析液，冻干即得载DOX/TPP‑DOX的FA‑PEG‑hyd‑PASP聚合物胶束。...
【技术特征摘要】
1.一种可逆转肿瘤耐药的线粒体靶向胶束递药系统，其特征是由嵌段化合物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸(FA-PEG-PASP)同时包裹阿霉素(DOX)和阿霉素-三苯基膦(TPP-DOX)，自组装得到聚合物纳米胶束，其中(1)叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(FA-PEG-hyd-PASP)的制备方法是：将叶酸溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，上述反应液在氮气保护下室温反应12h，随后将其滴入H2N-PEG-NH2的DMSO溶液中，混合液继续室温反应2h，反应结束后，加入5倍反应液量的水，过滤，滤液置于MW1000Da的透析膜中透析3天，冻干即得叶酸-聚乙二醇-NH2(FA-PEG-NH2)；将对乙酰基苯甲酸，NHS，EDCI依次加入DMSO中充分溶解，混合液室温搅拌反应5h后加入FA-PEG-NH2，室温条件下氮气保护反应过夜；反应结束后，加入10倍反应液量的水，并置于MW1000Da的透析膜中透析3天，冻干即得叶酸-聚乙二醇-对乙酰氨基酸(FA-PEG-...
【专利技术属性】
技术研发人员：周四元，宦梦蕾，崔晗，宋彦峰，腾增辉，成颖，刘道洲，刘苗，叶威良，张邦乐，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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