小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种完全利用小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(LCs)的方法。该方法步骤如下，首先将克隆团样hiPSCs制备成单散hiPSCs，用去除bFGF的E7培养基预处理培养2天；然后在不同时间点向分化培养基外加一定量小分子包括：DKK‑1,Noggin,Nicotinamide,IGF‑1,bFGF,Activin A和SU5402促进分化；最后采用手工剔除非RPE样细胞富集分化靶细胞(hiPSCs‑RPE)，并完成鉴定。按照本发明专利技术方法诱导，可以成功将hiPSCs分化为hRPE细胞，从而为采用自体细胞移植治疗RPE退性型疾病提供细胞来源。

【技术实现步骤摘要】
小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法
本专利技术属于生物科技
，尤其是一种完全利用小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。
技术介绍
视网膜是光传感器和视觉信息处理器，视网膜一旦受损很容易引起视力损伤。目前，治疗的最有效的方法就是通过细胞移植来取代已受损的视网膜细胞，特别是视网膜色素上皮细胞(RPE)。RPE是位于脉络膜和视网膜神经层之间的一层单层细胞，在维持光感受器细胞和视网膜正常功能上发挥重要作用。RPE细胞降解或受损是产生色素性视网膜炎、老年性黄斑病变、斯特格氏病等疾病的原因。在许多视网膜受损的动物模型中，通过视网膜下腔移植RPE细胞，能有效的恢复光感受器的功能，从而修复视力。但是，供体RPE细胞来源非常有限，而且异体移植存在免疫排斥问题。2006年，Yamanaka等首次实现将四种转录因子通过反转录病毒导入到小鼠皮肤成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞(ESCs)的多能性干细胞,并命名为“诱导多能性干细胞”(iPSCs)。iPSCs既具备了ESCs细胞一样的多能性，同时规避了ESCs所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备了较好的临床应用价值。本专利技术在此基础上设计了一种采用小分子诱导iPSCs分化为RPE的方法，从而为采用细胞移植治疗眼RPE退性型疾病奠定技术基础。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，该方法为治疗眼RPE疾病提供了新的方向，且诱导完全采用小分子，不依赖外源基因的导入，提高了未来用于临床应用的安全性，解决了现有技术中因通过异体视网膜下腔移植RPE细胞所带来的免疫排斥问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的克隆团样的hiPSCs培养获取单散hiPSCs，②将培养的单散hiPSCs用去除bFGF的E7培养基进行培养2天后进行分化培养，分化培养过程中加入小分子促进诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，小分子成分包括DKK-1、Noggin、Nicotinamide、IGF-1、bFGF、ActivinA和SU5402，然后手工剔除形态非RPE铺路石样的杂细胞后，传达培养，富集得到hiPSCs-RPE，③完成免疫荧光检测、逆转录PCR(RT-PCR)检测、蛋白印迹检测、荧光素钠渗漏检测、POS吞噬功能检测、Z-stack共聚焦膜极性检测。进一步的，所述步骤②中，分化培养基的成分包括MEM/F12、体积百分比1％的NEAA和体积百分比1％的N2，分化培养过程包括RPE早期诱导、RPE中期诱导、RPE后期诱导以及RPE成熟诱导，RPE早期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、50ng/mLNoggin、10mMNicotinamide(NIC)和10ng/mLIGF-1，RPE中期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、10ng/mLNoggin、5ng/mLbFGF、10mMNicotinamide和10ng/mLIGF-1，RPE后期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、10ng/mLIGF-1和100ng/mLActivinA，RPE成熟诱导过程中加入100ng/mLActivinA和10μMSU5402。进一步的，所述步骤②中富集得到hiPSCs-RPE后，用成熟RPE培养基进行培养，成熟RPE培养基主要含有：DMEM/HG、体积百分比1％FBS、100ng/mLActivinA、Sodiumpyruvate和GlutaMAX，培养第20天，细胞采用质量体积比0.25％EDTA胰蛋白酶进行消化传代，并用含有体积百分比10％FBS、100U/mLP/S的DMEM/HG培养基进行常规培养。进一步的，所述步骤①中，将获得的克隆团样的hiPSCs种植在体积百分比1％Matrigel孵育过的6孔板上，37℃二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代比例3:1；传代时使用质量体积比0.25％EDTA处理3-5min，当克隆边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1mL的E8培养基轻轻吹打，吹打次数不超过10次，收集细胞到新的体积百分比1％Matrigel孵育过的6孔板上继续培养；在每次传代后的第1天，培养基中添加10μMY-27632，对消化后的细胞吹打次数提高到30-50次，然后细胞悬液用40μm筛网进行过滤，除去细胞团；产生的单散细胞以1×106个/孔的密度种植到体积百分比1％Matrigel孵育过的6孔板上，传代第1天培养基中同样添加10μMY-27632，后续采用半量更换新鲜的E8培养基的培养方式进行单散hiPSCs培养。采用上述方案，本专利技术采用小分子诱导分化的有益效果如下：1)分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；2)小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；3)诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出视网膜色素上皮细胞，从而更适用于未来临床应用。下面结合附图对本专利技术作进一步描述。附图说明附图1为小分子诱导人源可诱导多能性干细胞hiPSCs分化为人的视网膜色素上皮细胞hRPE，即分化靶细胞hiPSCs-RPE；(A)为小分子诱导分化流程图；(B)为不同时间点小分子诱导单散hiPSCs分化为hiPSCs-RPE并富集的明场图；附图2为免疫荧光鉴定分化靶细胞hiPSCs-RPE特异蛋白表达；附图3为逆转录PCR鉴定靶细胞hiPSCs-RPE特异性基因表达；附图4为蛋白印迹鉴定分化靶细胞hiPSCs-RPE特异蛋白表达；附图5为鉴定分化靶细胞hiPSCs-RPE屏障功能；其中，(A)为荧光素钠渗漏检测在0，4，12，24和36小时时间点实验组hiPSCs-RPE，阳性对照组hRPE和阴性对照组hADSCs的荧光渗漏值并比较彼此的活性屏障功能；(B)为上皮细胞电阻模型TEER检测实验组hiPSCs-RPE，阳性对照组hRPE和阴性对照组hADSCs的细胞膜电阻，其中，*P<0.05表示差异显著，有统计学意义，#P>0.05表示差异不显著，无统计学意义；附图6为鉴定分化靶细胞hiPSCs-RPE吞噬和膜极性功能；(A)为检测带有ZO-1表达的hiPSCs-RPE和hRPE吞噬FITC-POS的功能；(B)为Z轴三维共聚焦检测带有ZO-1表达的hiPSCs-RPE和hRPE的极性。具体实施方式本专利技术的具体实施例如图1-6所示是小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其包括如下步骤，①培养人源可诱导多能性干细胞(hiPSCs)：将获得的克隆团样的hiPSCs种植在体积百分比1％Matrigel孵育过的6孔板上，37℃二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代比例3:1。为减少对hiPSCs的损害，传代时使用质量体积比0.25％EDTA处理3-5min，当克隆边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的克隆团样的hiPSCs培养获取单散hiPSCs，②将培养的单散hiPSCs用去除bFGF的E7培养基进行培养2天后进行分化培养，分化培养过程中加入小分子促进诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，小分子成分包括DKK‑1、Noggin、Nicotinamide、IGF‑1、bFGF、Activin A和SU5402，然后手工剔除形态非RPE铺路石样的杂细胞后，传达培养，富集得到hiPSCs‑RPE，③完成免疫荧光检测、逆转录PCR(RT‑PCR)检测、蛋白印迹检测、荧光素钠渗漏检测、POS吞噬功能检测、Z‑stack共聚焦膜极性检测。

【技术特征摘要】
1.一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的克隆团样的hiPSCs培养获取单散hiPSCs，②将培养的单散hiPSCs用去除bFGF的E7培养基进行培养2天后进行分化培养，分化培养过程中加入小分子促进诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，小分子成分包括DKK-1、Noggin、Nicotinamide、IGF-1、bFGF、ActivinA和SU5402，然后手工剔除形态非RPE铺路石样的杂细胞后，传达培养，富集得到hiPSCs-RPE，③完成免疫荧光检测、逆转录PCR(RT-PCR)检测、蛋白印迹检测、荧光素钠渗漏检测、POS吞噬功能检测、Z-stack共聚焦膜极性检测。2.根据权利要求1所述的小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤②中，分化培养基的成分包括MEM/F12、体积百分比1％的NEAA和体积百分比1％的N2，分化培养过程包括RPE早期诱导、RPE中期诱导、RPE后期诱导以及RPE成熟诱导，RPE早期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、50ng/mLNoggin、10mMNicotinamide(NIC)和10ng/mLIGF-1，RPE中期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、10ng/mLNoggin、5ng/mLbFGF、10mMNicotinamide和10ng/mLIGF-1，RPE后期诱导过程中加入10ng/mLDKK-1、10ng/mLIGF-1和100ng/mLActivinA，RPE成熟诱导过程中加入100ng/mLActivinA和10μMSU5402。3.根据权利要求1或2所述的小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤②中富集得到hiPSCs-RPE后，用成熟RPE培养基进行培养，成熟RPE培养基主要含有：DMEM/HG、体积百分比1％FBS、100ng/mLActivinA、Sodiumpyruvate和GlutaMAX，培养第20天，细胞采用质量体积比0.25％EDTA胰蛋白酶进行消化传代，并用含有体积百分比10％FBS、100U/mLP/S的DMEM/HG培养基进行常规培养。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓令，陈建苏，葛仁山，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33