一种小鼠成纤维细胞及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种小鼠成纤维细胞及其用途。属于细胞生物学领域。该细胞命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL‑041，保藏编号为CCTCC NO：C201714。经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞用于正常原代上皮细胞与原代肿瘤细胞的分离和传代培养。由此获得的人肺正常和肺癌的原代上皮细胞在显微镜下观察，状态鲜活，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。可用于人或动物正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的病毒感染模型，体外正常细胞针对不同药物的药敏检测，以及癌症病人个体化治疗的药物筛选和抗癌新药的研发。

A mouse fibroblast and its uses

The invention discloses a mouse fibroblast and its uses. It belongs to the field of cell biology. The cell was named as mouse fibroblast MFC/HL 041, and the preservation number was CCTCC NO:C201714. Mouse fibroblasts irradiated with drug mitogen C or radiation were used for isolation and subculture of normal primary epithelial cells and primary tumor cells. The primary epithelial cells of normal lung and lung cancer were observed under microscope. They were in vivid state, closely arranged, well-defined, stereoscopic and polygonal. It can be used in physiological research of human or animal normal cells, virus infection model of normal cells in vitro, drug susceptibility test of normal cells in vitro to different drugs, and drug screening for individual treatment of cancer patients and research and development of new anti-cancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠成纤维细胞及其用途
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种小鼠成纤维细胞及其用途。
技术介绍
众所周知，人体重要的器官是很难被替换的，而且这种特异性分化器官的组成细胞也是很难再生的，更不用说在体外进行连续的培养增殖。因此，人们对于机体正常细胞功能的认识，绝大多数主要来自于体外培养的“癌细胞”所得到的研究结果，而非源于真正的正常细胞。为了在体外进行原代细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如通过导入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因来建立各种永生化细胞，获得所谓“正常”的细胞系。然而，该方法虽然可以延长体外细胞存活的寿命(代数)，但是遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常细胞丢失其正常生理功能，如p53和pRB信号通路常常被抑制，因而得到的实验数据可靠性大大降低。由于目前缺乏有效的体外培养原代上皮细胞的技术，上述经遗传操作永生化的细胞在当今世界医学和生命科学领域中仍然备受青睐，在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官；在癌症研究领域，它们还常常被用来作为“正常细胞”的对照，并且在市场上的价格还非常昂贵。综上所述，目前急需解决的问题是，如何快速、有效地进行组织器官来源的原代上皮细胞的增殖以及这些上皮细胞的传代培养，并且能有效地延长上皮细胞的培养代数，同时又不能改变细胞的遗传背景。传统的人正常上皮细胞原代培养方法存在培养出的细胞活性差、培养率低、易污染和操作繁琐等缺点。为了解决此类问题扩大人类正常上皮细胞原代培养的研究及应用，近年来国内外的许多研究人员对哺乳动物正常上皮细胞尤其是人正常上皮细胞的原代培养过程进行了不断改进和新的探索。此外，人类原代上皮组织通常来源于患者组织，除基于患者对手术及实验方案知情同意外，必须通过医院伦理委员会批准，因此人类原代上皮细胞来源非常有限。培养原代细胞是指从活体里取得器官组织或者细胞后立即用于培养，整个过程包括活体取材、分离提纯、细胞培养、细胞传代和生物学鉴定等基本部分。其中，人类上皮细胞的培养是所有类型细胞中培养难度较大的，培养出的细胞在细胞数量、活性、培养周期、传代保存上都受到诸多限制。上皮细胞是分布在体表或腔道表层的一类细胞，在不同部位的上皮细胞功能存在差异，如在体表的上皮细胞具有保护功能，在消化道或呼吸道表层的上皮细胞除具有保护功能外还包含分泌、排泄和吸收的作用。有研究发现某些癌症是由上皮细胞的病变所引发的，如卵巢癌来源于卵巢表面上皮的病变。由此可知，建立优越的原代上皮细胞的培养体系，尽可能地培养出在结构和功能上与体细胞相近的正常上皮细胞、原代肿瘤细胞显得尤为重要。然而就现有的上皮细胞培养技术来看，还尚未建立稳定的共培养体系用以提供大量的优质的上皮细胞为相关实验研究提供研究模型。目前小鼠成纤维细胞原代培养的应用主要有：(1)用于细胞保种；(2)用于分子生物学研究；(3)用于基因治疗相关研究。以往的在体外培养小鼠或人胚胎干细胞、诱导性多能干细胞时，有研究将小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞与干细胞共培养，可为干细胞提供其生长和增殖过程中所需的营养。参与共培养的小鼠成纤维细胞需要经过紫外射线照射或者药物抑制剂处理，目的是使该细胞失去增殖能力，但是在一定时间内仍然具有对支持细胞提供营养并维持共培养环境的能力。小鼠成纤维细胞作为饲养层是如何支持人类胚胎干细胞和全能干细胞的生长，目前机制不十分清楚。有研究发现滋养层细胞可以分泌FGF、VEGF、IGF等生长因子，促进干细胞的克隆生长，另外还可以分泌白血病抑制因子(LIF)等，抑制干细胞的分化。同时也有研究发现小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞分泌的ActivinA和LIF，支持全能干细胞的自我更新和未分化特性，表明小鼠成纤维细胞饲养层为人类胚胎干细胞和全能干细胞生长提供了复杂的微环境。虽然目前对于小鼠成纤维细胞饲养层的共培养益处尚无一致意见，但是，在现有方法学基础上建立稳定的小鼠成纤维细胞饲养层与原代上皮细胞的接触式共培养模型，并利用其分泌的生长因子促进原代上皮细胞的克隆生长、维持其生物学特性，可为正常上皮细胞、原代肿瘤细胞相关领域的研究构建新平台。此外，原代小鼠成纤维细胞取材容易、价格低廉，在扩增培养饲养层细胞中最为常用。目前较规范的原代小鼠成纤维细胞分离培养方法为：采用断颈法处死孕鼠，将孕鼠放入75％的酒精中浸泡后取出，放入无菌超净台中，用镊子和剪刀依次剪开皮肤和内膜，找到胚胎。取出胚胎，在装有0.9％生理盐水的100mm培养皿中洗涤3-5次，剪刀剪碎后用0.25％的胰蛋白酶消化15-20min，用终止液终止消化，1000rpm离心5-10min。将得到的细胞沉淀用含8-10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬后接种到细胞预先用0.1-0.5％的明胶溶液包被0.5-2小时的细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。但是，采用该方法的饲养层细胞获得率仍然非常低、细胞增值缓慢，且明胶溶液包被过程较繁琐。近年来原代小鼠成纤维细胞分离培养已有诸多改良优化，例如优化消化酶条件建立消化酶组合物、梯度密度分离或进行生物学特性鉴定获取纯度较高的原代小鼠成纤维细胞。然而，应用于生物医学研究领域的哺乳动物细胞被错误鉴定和交叉污染是目前普遍存在的突出问题。有数据统计，目前国外实验室有20％左右的细胞株被错误鉴定和交叉污染，NIH和ATCC等研究机构近两年都对此发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定获得足够认定个体的遗传信息。细胞的交叉污染和遗传背景不清晰的问题在国内也非常严重，因此对研究的细胞进行标准化的细胞鉴定显得尤为重要。建立新的稳定的细胞系并对其身份进行证实，使其在公共的数据库中具有专属的基因签名，克服该细胞系交叉污染的情况，可以保证研究者的研究产品价值。近年来，大量研究表明STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，STR基因分型应用于细胞鉴定已被ATCC等机构强烈推荐。STR基因分型是运用多重PCR技术从可用的DNA材料中扩增短串联重复序列来获取信息的一种分析方法，短串联重复序列是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，其核心序列为2-7bp，重复次数通常为10-30次，不同个体来源的细胞在不同STR位点具有特异性的重复次数，使得不同细胞具有其特征性的图谱。因此，建立一种高效的原代小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞的培养方法是人或哺乳动物原代上皮细胞培养的关键，其中更关键的是作为饲养层细胞的原代小鼠成纤维细胞不仅在获得率、纯度、传代稳定性方面具有较以往方法的优势，最重要的是其遗传背景清晰、排除细胞被错误鉴定和交叉污染的情况，对其进行标准化的细胞鉴定确定特征性，保证相关研究的产品价值。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种小鼠成纤维细胞，来源于Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织，为正常二倍体细胞，基因分型鉴定为国内外从未登记注册过，经药物丝裂酶素C或放射线辐照处理后的小鼠成纤维细胞，可用于正常原代上皮细胞或原代肿瘤细胞的分离和传代培养，共培养所得到的上皮细胞可应用于正常细胞的生理学、药物安全性评价、再生医学等相关研究；共培养得到的正常/肿瘤配对细胞可应用于肿瘤发病机理的研究，癌症病人个体化治疗的药物筛选和抗癌新本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠成纤维细胞，命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL‑041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714，该细胞来源于16～18天Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织，短串联重复序列基因型以10个“短串联重复序列基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，18‑3/17/21，4‑2/19.3，6‑7/12，9‑2/15，15‑3/20.3，6‑4/14.3，12‑1/19，5‑5/13，X‑1/26。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠成纤维细胞，命名为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201714，该细胞来源于16～18天Swiss小鼠正常的胚胎皮肤组织，短串联重复序列基因型以10个“短串联重复序列基因座/等位基因长度”来表示：Amel/X，18-3/17/21，4-2/19.3，6-7/12，9...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晖，
申请(专利权)人：李晖，
类型：发明
国别省市：湖北,42