一种生物法制备L-半胱氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种恶臭假单胞菌（Pseudomonsas putida）HW‑3菌株及用于制备L‑半胱氨酸的方法，属于生物工程应用领域。本发明专利技术的技术方案是：一株恶臭假单胞菌株（Pseudomonsas putida）HW‑3，其菌种保藏编号为CGMCC No.15553。该菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。经过筛选提供了一株能够生物转化DL‑ATC制备L‑半胱氨酸的菌株HW‑3，经鉴定为恶臭假单胞菌。该菌株生物转化制备L‑半胱氨酸过程中，L‑半胱氨酸产量高，反应条件温和，可控，环保节能，具有良好的工业应用前景。

A method of preparing L- cysteine by biological method

The invention relates to a strain HW_3 of Pseudomonas putida and a method for preparing L_cysteine, belonging to the field of bioengineering application. The technical scheme of the invention is: a Pseudomonas putida HW_3 strain, the preservation number of which is CGMCC No. 15553. The preservation unit of the strain is the general microbial center of the Chinese microbiological preservation management committee. A strain HW_3 was screened and identified as Pseudomonas putida, which could biologically convert DL_ATC to L_cysteine. In the process of L_cysteine production by this strain, the yield of L_cysteine is high, the reaction conditions are mild, controllable, environmental protection and energy saving, so it has a good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种生物法制备L-半胱氨酸的方法
本专利技术属于生物工程应用领域，涉及一种利用恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）HW-3微生物转化法（酶法）制备L-半胱氨酸的方法。
技术介绍
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛用于含硫化合物如甲硫氨酸、硫胺素、生物素及辅酶A的合成。另外，L-半胱氨酸通过形成二硫键，保证蛋白质正确折叠、组装并维持蛋白的稳定性；有研究表明细胞周质中的L-半胱氨酸能提高大肠杆菌对过氧化氢的耐受性。鉴于L-半胱氨酸在细胞代谢过程中的重要生理作用，它也被常用于医药中间体、食品添加剂及化妆品等行业。半胱氨酸的生产方法大致有毛发水解液提取法、化学合成法和生物法（微生物发酵法和酶法）。水解法和化学合成法收率较低，操作步骤多，生产过程产生大量不易处理的废弃物，造成环境污染，面临较大的环保压力；生物法制备半胱氨酸，具有特异性强，生产工艺简单，副反应和副产物少等优点。目前，已广泛使用以基因工程菌发酵制备L-半胱氨酸的方法与野生菌发酵制备法相比，具有更高的底物转化率，但是底物转化率只有约30%，仍处于较低水平，这不能满足L-半胱氨酸的工业化生产要求。通过不断开发微生物酶的潜在催化功能，使工艺成熟的化学合成方法与微生物酶法相结合，已建立了一种崭新的化学技术与生物技术相互交叉、相互结合、互相渗透的化学生物技术。以化学合成制取的DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-2-Amino-△2-thiazoline-4-CarboxylicAcid,DL-ATC）经微生物酶法转化制取L-半胱氨酸正引起人们的关注。该方法转化效率高，产物纯化简便，与发酵法相比，有较大的优势。日本已报道了用DL-ATC为原料经微生物酶法制取L-半胱氨酸的生产工艺。本专利技术介绍了一种利用恶臭假单胞菌微生物转化法制备半胱氨酸的方法，经分批补料发酵，并使用渗透剂处理菌体，L-半胱氨酸单位产量提高了7倍，转化液中最终产物积累浓度可达到24.6g/L。并且以发酵液制备透性细胞，简化操作过程，更易实现产业化。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的是克服化学法和发酵法制备L-半胱氨酸工艺的不足，提供一株高选择性的催化DL-ATC生物合成L-半胱氨酸的恶臭假单胞菌PseudomonasputidaHW-3，并利用该菌株制备L-半胱氨酸。本专利技术的技术方案是：一株恶臭假单胞菌HW-3，其菌种保藏编号为CGMCCNo.15553。该菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏日期为2018年04月03日。本专利技术菌株的分类命名是：恶臭假单胞菌，拉丁文名称为：Pseudomonasputida。本专利技术提供的菌株是按照如下方法筛选获得的：取烟台、威海土样1.0g置于摇床160rpm，30℃富集培养3次，每次24h。然后将稀释菌液涂布于固体平板上，待长出单菌落后，接种到斜面培养基作为初筛菌种。将初筛菌种转入液体培养基进行培养，离心获得菌体，用PBS缓冲液洗涤数次后，进行L-半胱氨酸的生物制备，经检测选取活力较高的菌株作为菌种。本专利技术提供菌株的鉴定：菌落形态：在平板培养基上30℃培养48h，得到淡白色，圆形，扁平菌落，表面湿润光滑，边缘模糊，经鉴定为革兰氏阳性菌。以提取的细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株HW-3的16SrDNA序列，将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增出了一条长约1.4kb的片段，如图1，符合预期结果。经测序为1385bp的基因片段。将基因序列的测序结果与Genbank中的数据进行比对分析发现，本专利技术中提供的微生物菌株HW-3与Pseudomonasputida（KT970643.1）同源性最高（homology,100％/1365bps,basedon16SrDNA），根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于16SrDNA序列的同源性高于95%，鉴定菌基本属于对照菌。结合生理生化实验，鉴定该微生物菌株属于恶臭假单胞菌。本专利技术中的菌株用于制备L-半胱氨酸，以DL-ATC为原料，以经发酵培养获得的HW-3菌体作为催化剂，于pH6.0-8.5，20-40℃进行生物转化，最终获得产物L-半胱氨酸。具体步骤如下：第一步：发酵种子液的制备将HW-3接种到种子培养基中，摇床转速为100-200rpm，20-45℃条件下培养15-60h，获得发酵种子液。其中此处所用培养基组成成分为：麦芽糖1.0-30.0g/L，DL-ATC0.1-3.0g/L，氯化铵0.2-2.0g/L，氯化镁0.05-0.4g/L，氯化亚铁0.05-0.5g/L，酵母浸膏0.2-10.0g/L，牛骨蛋白胨2-20.0g/L，磷酸氢二钠0.2-2.0g/L，氯化钠0.1-1.2g/L，溶剂为水。第二步：菌体发酵及生物转化将发酵种子液以1-8%的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为：摇床转速为100-200rpm，20-45℃条件下培养15-60h。发酵培养基组成成分为：麦芽糖1.0-30.0g/L，DL-ATC0.1-3.0g/L，糖蜜0.2-2.0g/L，氯化镁0.05-0.4g/L，氯化亚铁0.05-0.5g/L，硫酸铵1.0-10.0g/L，磷酸氢二钠0.1-2.0g/L，氯化钠0.1-1.2g/L，氯化锰0.02-0.2g/L，溶剂为水。发酵结束后，向发酵液中加入0.05-3.5%的渗透剂氯仿，在10-50℃下处理0.2-4.0h，制备透性细胞。透性细胞制备过程可以在摇瓶进行，也可以在发酵罐进行，为增加菌体与渗透剂的接触，增强处理效果，处理过程要进行震荡或搅拌。在摇瓶制备透性细胞时，将其置于摇床内震荡处理，摇床转速60-200rpm；在发酵罐制备透性细胞时，开启搅拌，搅拌转速为100-300rpm。在三角瓶或发酵罐中，以透性细胞为生物催化剂，加入终浓度为0.05-3.0g/L的DL-ATC后于20-60℃下恒温发酵转化5-40h。发酵转化结束后，取发酵液进行8000-12000rpm，离心1-5min，收集离心上清液。以酸式茚三酮法测定微生物活力，筛选工作菌株。发酵培养及生物转化过程可在摇瓶中进行，也可在发酵罐中进行。转化过程应注意控制pH为6.0-8.5。酶活力定义：在上述条件下，1h内转化底物生成1μg产物L-半胱氨酸所需的酶量作为一个酶活力单位(U)。酶活力以每毫升发酵液所含的酶活力单位数表示(U/mL)。本专利技术的有益效果为：经过筛选提供了一株能够生物转化DL-ATC制备L-半胱氨酸的菌株HW-3，经鉴定为恶臭假单胞菌。该菌株生物转化制备L-半胱氨酸过程中，L-半胱氨酸产量高，反应条件温和，可控，环保节能，具有良好的工业应用前景。底物转化率可达到83%。【附图说明】图1PCR扩增的菌株HW-316SrDNA序列琼脂糖凝胶电泳图图2氯仿浓度对透性细胞活力影响图3氯仿处理时间对透性细胞活力的影响图4不同pH对透性细胞活力的影响图5底物浓度对透性细胞活力的影响【具体实施方式】下面结合具体实施实例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施实例1：微生物筛选以种子培养基对土样样品进行富集培养，种子培养基组成为：麦芽糖20.0g/L，DL-AT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株恶臭假单胞菌株HW‑3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 15553 。

【技术特征摘要】
1.一株恶臭假单胞菌株HW-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNo.15553。2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌株HW-3在制备制备L-半胱氨酸中的应用。3.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌株HW-3制备L-半胱氨酸的方法，其特征在于，以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸为原料，以经发酵培养获得的HW-3菌体作为催化剂，于pH6.0-8.5，20-40℃进行生物转化，最终获得产物L-半胱氨酸。4.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌株HW-3制备L-半胱氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：发酵种子液的制备：将HW-3接种到种子培养基中，摇床转速为100-200rpm，20-45℃条件下培养15-60h，获得发酵种子液；第二步：菌体发酵及生物转化：将发酵种子液以1-8%的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为：摇床转速为100-200rpm，20-45℃条件下培养15-60h；发酵结束后，向发酵液中加入0.05-3.5%的渗透剂氯仿，在10-50℃下处理0.2-4.0h，制备透性细胞；透性细胞制备过程可以在摇瓶进行，也可以在发酵罐进行，为增加菌体与渗透剂的接触，增强处理效果，处理过程要进行震荡或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李广生，丛日刚，杨涛，肖川，曲欣欣，王祥法，夏俊刚，
申请(专利权)人：威海迪素制药有限公司，迪沙药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37