高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法。该方法包括如下步骤：采用真菌ITS2区引物对待测银耳菌种的基因组进行PCR扩增建库，高通量测序，然后将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行OTU聚类分析，对比真菌ITS序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的OTU信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。本发明专利技术方法结合不同配比下银耳菌种子实体生长情况，定量评估银耳和香灰菌不同配比对子实体形成的影响，为银耳生产中的菌种的制备提供可靠的参考标准。特别适用于各食用菌服务和研究单位，以突破或制定出相应的技术壁垒，保障食用菌生产的安全性和稳定性。

High throughput sequencing technology for detecting the ratio of tremella and fungus in Tremella strains

The invention discloses a method for detecting the proportion of Tremella fuciformis and cinerea in Tremella fuciformis by high-throughput sequencing technology. This method includes the following steps: using the ITS2 region primers of fungi to amplify the genome of Tremella fuciformis strains by PCR, high-throughput sequencing, and then filtrating the data of high-throughput sequencing, OTU clustering analysis was carried out according to 97% similarity, and the ITS sequence database of fungi was compared to obtain Tremella fuciformis and Botrytis cinerea pairs. According to the OTU information, the quantitative analysis of the proportion of Tremella fuciformis and Botrytis cinerea in the tested Tremella species can be realized. The method quantitatively evaluates the influence of Tremella fuciformis and cinerea fuciformis on the formation of fruiting bodies in combination with the growth of Tremella fuciformis seeds in different proportions, and provides a reliable reference standard for the preparation of Tremella fuciformis strains in Tremella fuciformis production. Especially suitable for various edible fungi services and research units to break through or formulate the corresponding technical barriers to ensure the safety and stability of edible fungi production.

【技术实现步骤摘要】
高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法
本专利技术涉及食用菌特别是银耳菌种中银耳和香灰菌定量配比检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法及其应用。
技术介绍
中国是食用菌生产大国，年产量约占世界的3/4，在我国农业生产中食用菌已位居第五大产业，仅次于粮食、蔬菜、果树、油料。银耳又称白木耳，雪耳，在真菌中隶属于担子菌门(Basidiaomycota)、伞菌亚门(Agaricomycotina)、银耳纲(Tremellomycetes)、银耳目(Tremellales)、银耳科(Tremellaceae)、银耳属(Tremella)，是我国传统食药兼用真菌，它不仅是我国医学宝库中久负盛名的良药，也是滋补佳品和筵席佳肴。我国是银耳人工栽培的发源地，也是世界银耳生产和出口最多的国家，银耳年总产量已接近40万吨。其中以袋料栽培为主要模式的福建省是银耳生产产量最大的省份，其始终占据全国银耳总产量的90％以上。与大多数生产栽培的食用菌种类不同，银耳有其非常独特的生活史，它必须在伴生真菌香灰菌的协同作用下才能完成其生活史。银耳自身没有分解木质纤维素与淀粉基质的能力，不能单独在木质纤维素上生长，只有与香灰菌进行共生培养时才能正常生长发育并且形成子实体。香灰菌在银耳的培养过程中充当了伴生菌的角色，分泌基质降解酶对栽培料基质进行分解，为银耳的生长发育提供营养。因此在生产上银耳菌种的制备过程中银耳和香灰菌的比例是非常关键的，直接影响后期银耳子实体生长发育及其商业价值。然而在实际的生产过程中，这一关键步骤经常被经验所代替，菌种制备者根据银耳菌丝生长较慢，香灰菌丝生长快的这一特点利用经验观察的手段来进行银耳和香灰菌的配制，从而使这一过程充满了不确定性和不可控性。随着生产的持续开展，银耳菌种的质量就无法保证，在实际生产中往往出现出耳率低或不出耳等现象。并且由于不能定量地配比银耳和香灰菌丝，给菌种的选育特别是对于新分离的野生种带来很大的障碍。因此，对银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量检测是生产中最为关键的决定性一环，在定量的基础上，提出在实际生产中可以运用的菌种选育方法，以突破食用菌菌种生产中的技术壁垒。高通量测序技术具有高效、快速、准确、经济的特点。目前，此项技术已经广泛应用于环境微生物、人类和植物病原微生物的检测等方面。但是在食用菌菌种的检测方面，尚没有利用高通量测序技术的相关研究和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法及其应用。第一方面，本专利技术要求保护一种检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法。本专利技术所提供的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法，是采用高通量测序的方法检测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比。进一步地，所述方法可包括如下步骤：采用真菌ITS2区引物对待测银耳菌种的基因组进行PCR扩增建库，高通量测序，然后将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行OTU聚类分析，对比真菌ITS序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的OTU信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。更进一步地，所述方法具体可包括如下步骤：(1)提取待测银耳菌种的基因组DNA；(2)对提取的基因组DNA进行质量检测；(3)采用真菌ITS2区引物对基因组进行PCR扩增建库；(4)通过Miseq平台进行高通量测序；(5)将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行OTU聚类分析，对比真菌ITS序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的OTU信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，具体是采用月桂酸钠法提取所述待测银耳菌种的基因组DNA的。在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，采用的所述真菌ITS2区引物中的特异性部分的序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。进一步地，所采用的引物是带有barcode的特异性引物。在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，具体是按照如下标准对所述高通量测序所得结果数据进行过滤去杂的：a1)过滤读长(read)尾部质量值20以下的碱基，设置20bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后100bp以下的读长(read)；a2)根据双末端测序读长(PEreads)之间的重叠(overlap)关系，将成对读长(reads)拼接成一条序列，最小重叠(overlap)长度为10bp；a3)提取非重复序列，并去除没有重复的单序列。其中，双末端测序读长(PEreads)就是paired-endreads。reads(读长)是高通量测序中一个反应获得的测序序列。在测序过程中，一条DNA分子的两端都可以测序。先测其中的一端，获得一个reads，然后再转到另一端测序，获得另外一个reads。得到的这两个reads就是PEreads。在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，具体是利用usearch方法进行所述OTU聚类分析的。当然也可以采用usearch方法外的其他方法进行所述OTU聚类分析。在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，所述真菌ITS序列数据库具体为NCBI数据库和/或UNITE数据库。第二方面，本专利技术要求保护所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)在评估银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比对银耳子实体的形成和/或发育的影响中的应用。第三方面，本专利技术要求保护所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)在指导银耳菌种配制中的应用。第四方面，本专利技术要求保护一种指导银耳菌种配制的方法。本专利技术所提供的指导银耳菌种配制的方法，具体可包括前文所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)中的全部步骤和如下步骤：结合银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比进行银耳子实体发育试验，试验过程中观察银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比下银耳子实体的形成和/或发育情况，从而为生产中的银耳菌种配制提供参考标准。第五方面，本专利技术还要求保护一种具体的配制银耳菌种的方法。本专利技术所提供的配制银耳菌种的方法，具体包括如下步骤：将银耳菌种配制成其中银耳菌丝含量高于1倍香灰菌菌丝含量且低于2倍香灰菌菌丝含量。更加具体地，是将银耳菌种配制成其中银耳菌丝含量为香灰菌菌丝含量的1.25倍。本专利技术的检测方法，利用高通量测序技术，对银耳菌种的基因组DNA进行测序，并通过生物信息学分析对银耳菌种中银耳和香灰菌的配比进行分析，结合不同配比下银耳菌种子实体生长情况，定量评估银耳和香灰菌不同配比对子实体形成的影响，为银耳生产中的菌种的制备提供可靠的参考标准。特别适用于各食用菌服务和研究单位，以突破或制定出相应的技术壁垒，保障食用菌生产的安全性和稳定性。附图说明图1为不同银耳/香灰菌配比条件下银耳子实体鲜重。标注不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。图2为不同银耳/香灰菌配比条件下银耳子实体干重。标注不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。图3为不同银耳/香灰菌配比条件下废菌包的重量。标注不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法，是采用高通量测序的方法检测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比。

【技术特征摘要】
1.一种检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法，是采用高通量测序的方法检测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：采用真菌ITS2区引物对待测银耳菌种的基因组进行PCR扩增建库，高通量测序，然后将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行OTU聚类分析，对比真菌ITS序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的OTU信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)提取待测银耳菌种的基因组DNA；(2)对提取的基因组DNA进行质量检测；(3)采用真菌ITS2区引物对基因组进行PCR扩增建库；(4)通过Miseq平台进行高通量测序；(5)将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行OTU聚类分析，对比真菌ITS序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的OTU信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，是采用月桂酸钠法提取所述待测银耳菌种的基因组DNA的；和/或步骤(3)中，采用的所述真菌ITS2区引物中的特异性部分的序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；和/或步骤(5)中，是按照如下标准对所述高通量测序所得结果数据进行过滤去...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新展，孙淑静，白逢彦，张琪辉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，福建农林大学，
类型：发明
国别省市：北京,11