测序技术中的脱靶捕捉降低制造技术

本文中呈现了用于增强核酸文库(10)中靶序列(14)的特异性富集的方法和组合物。可以使用脱靶杂交探针(60)来减少靶向测序工作流中核酸文库(10)的脱靶区域的结合和/或捕捉。脱靶杂交探针对于已知对特定组的杂交探针(20)产生脱靶测序读段的位置可以是特异性的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测序技术中的脱靶捕捉降低对相关申请的交叉引用本申请要求于2015年10月7日提交的标题为“DATA-GUIDEDDESIGNOFHYBRIDCAPTUREOFF-TARGETREDUCERS”的美国临时申请No.62/238,411的优先权，其公开内容通过引用并入本文用于所有目的。专利技术背景本公开一般涉及核酸测序
更具体地，本公开涉及用于富集靶物捕捉并且降低靶向测序工作流中待测序的核酸的脱靶捕捉的技术。下一代测序(NGS)平台的测序方法通常利用核酸片段文库。在靶向测序技术中，从核酸文库中分离含有基因组的感兴趣基因或区域的片段的亚组并对其测序。使用NGS的靶向性方法使研究人员将时间、费用和数据分析集中在特定的感兴趣领域。此类靶向分析可以包括外显子组(基因组的蛋白质编码部分)、感兴趣的特定基因(定制内容)、基因内的靶物、或线粒体DNA。靶向性方法与更全面的全基因组测序方法形成对比，但也涉及对所有用户可能不感兴趣的基因组测序区域。在靶向测序技术的一个实例中，杂合捕捉方法使用与核酸文库中的靶序列杂交的探针组或集。探针与靶序列的杂交允许将这些序列与测序文库中的片段的剩余部分分开。通过仅靶向核酸文库的一部分，杂合捕捉方法避免了不含感兴趣序列的脱靶(off-target)核酸片段的测序。然而，与基于扩增子的靶物富集方法不同，杂合捕捉方法具有较高的脱靶测序率，并且继而降低了中靶(on-target)特异性。例如，尽管使用商业杂交封闭剂如Cot1、tRNA、鲑鱼精DNA、聚(dIdC)和靶向文库片段通用衔接头的封闭剂，但某些杂合捕捉方法通常仅实现40％-60％的效率。脱靶读段不仅浪费测序产率，而且还潜在地损害低频率的体细胞突变的变体调用(variantcalling)。因此，需要改进的富集方法，其在靶向测序技术中提供较高的特异性。专利技术概述本文中呈现了用于富集核酸文库中的靶序列并通过一组靶物杂交探针降低脱靶序列捕捉的技术。因为靶物杂交探针对它们的核酸靶物具有不完全特异性，所以使用一组靶物杂交探针的测序运行也可以包括代表脱靶的序列的一定百分比的读段。例如，在外显子组测序反应中，某些杂交探针可以连同靶序列一起从核酸文库中拉下内含子或基因间序列。这些脱靶片段一旦被拉下就存在于被测序的核酸片段合并物中。虽然通常弃去代表脱靶读段的测序信息，但是本技术使用获得的这些脱靶读段的测序信息来设计杂交探针，所述杂交探针对于脱靶序列是特异性的并且用于从通过靶物特异性杂交探针捕捉的片段合并物中分离和/或除去包含这些序列的片段。脱靶杂交探针是基于分析用一组靶物杂交探针进行的杂合捕捉测序运行的脱靶读段而设计的。在某些实施方案中，中靶探针设计也可以基于样品间的系统性脱靶分析以改善靶物杂交探针对其期望靶物的特异性。本文中呈现了降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法。方法包括以下步骤：提供一组脱靶杂交探针，所述脱靶杂交探针特异性结合存在于从样品产生的核酸文库中的多个脱靶序列，所述核酸文库包含多个核酸片段并提供一组靶物特异性杂交探针，所述靶物特异性杂交探针特异性结合存在于核酸文库中的多个靶序列。方法还包括以下步骤：在脱靶杂交探针与脱靶序列杂交的条件下使脱靶杂交探针与核酸文库接触，并在靶物特异性杂交探针与靶序列杂交的条件下使靶物特异性杂交探针与核酸文库接触。方法还包括以下步骤：从核酸文库中选择与靶物特异性杂交探针结合的一组核酸片段；并且对与靶物特异性杂交探针结合的该组核酸片段测序。本文中还呈现了提供用于靶向测序反应中的脱靶序列捕捉的探针的方法。方法包括接收针对一组靶物特异性杂交探针的请求的步骤。方法还包括以下步骤：使靶物特异性杂交探针与从参照样品产生的参照核酸文库接触，所述核酸文库包含多个核酸片段，以产生与靶物特异性杂交探针结合的靶物特异性和脱靶核酸片段的参照组，并将与靶物特异性杂交探针结合的核酸片段的参照组与未结合的核酸片段分开。方法还包括以下步骤：对核酸片段的参照组测序以产生参照测序数据；鉴定参照测序数据中的脱靶序列；以及基于鉴定的脱靶序列提供一组脱靶杂交探针。本文中还呈现了用于降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的测序试剂盒，其包括一组脱靶杂交探针，该脱靶杂交探针特异性结合存在于从样品产生的核酸文库中的多个脱靶序列，所述核酸文库包含多个核酸片段，和一组特异性结合存在于核酸文库中的多个靶序列的靶物特异性杂交探针。在下面的附图和描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。其它特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。附图简述图1是结合核酸文库的脱靶片段的靶物特异性杂交探针的示意图；图2显示了来自两种细胞系的六个样品的脱靶读段的基因组浏览器视图，所述脱靶读段具有相似覆盖的靶向区域(左侧)和脱靶区域(右侧)处的读段分布；图3是显示脱靶读段的基因组分布的图；图4是证明第一样品的靶探针和脱靶峰之间的相似性的图；图5是证明第二样品的靶探针和脱靶峰之间的相似性的图；图6是根据本公开的实施方案的提供脱靶杂交探针的方法的流程图；图7是根据本公开的实施方案的降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法的流程图；图8是根据本公开的实施方案的降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的竞争性封闭方法的示意图；图9是根据本公开的实施方案的降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的预封闭方法的示意图；图10是根据本公开的实施方案的降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的预澄清(pre-clearing)方法的示意图；图11是根据本公开内容的实施方案的降低与衔接子封闭剂结合使用的靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法的示意图；图12是根据本公开的实施方案的降低与衰减剂(attenuator)结合使用的靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法的示意图；图13是根据本公开实施方案的根据探针结合分离的核酸文库片段的示意图；图14是证明在预澄清之后在脱靶峰上的显著覆盖下降的图，其中每个点表示对照(x轴)和来自预澄清方案的相同样品(y-轴)中的脱靶峰的读段覆盖；图15是证明预澄清后的脱靶峰上的显著覆盖下降的图，其中每个点代表对照(x轴)和来自预澄清方案的相同样品(y轴)中的脱靶峰的读段覆盖；图16是证明预澄清后的脱靶峰上的显著覆盖下降的图，其中每个点代表对照(x轴)和来自预澄清方案的相同样品(y-轴)中的脱靶峰的读段覆盖；图17是证明中靶区域上的覆盖增加和下降的图，其中点表示对照(x轴)和具有预清洁(pre-cleaning)的相同样品(y轴)中的中靶区域的读段覆盖；图18是证明在中靶区域上的覆盖增加和下降的图，其中点表示对照(x轴)中和具有预清洁的相同样品(y轴)中的中靶区域的读段覆盖；图19是证明在中靶区域上的覆盖增加和下降的图，其中点表示对照(x轴)和具有预清洁的相同样品(y轴)中的中靶区域的读段覆盖；和图20是可以结合本公开的实施方案使用的测序装置的框图。专利技术详述经由通过杂交探针的结合选择靶序列的杂合捕捉方法与高脱靶结合率和低中靶特异性相关联。本技术通过使用数据引导方法降低杂合捕捉测序工作流中的脱靶序列的存在来改善测序效率。虽然某些技术可以使用封闭剂或结合衰减剂来影响探针结合，但此类方法不是数据引导的。例如，鲑鱼精DNA可以用于防止探针与反应表面的非特异性结合。然而，非特异性封闭剂不能阻止靶物特异性探针结合与靶序列具有相似性的脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法，其包括：提供一组脱靶杂交探针，其特异性结合存在于从样品产生的核酸文库中的多个脱靶序列，所述核酸文库包含多个核酸片段；提供一组靶物特异性杂交探针，其特异性结合存在于所述核酸文库中的多个靶序列；在所述脱靶杂交探针与所述脱靶序列杂交的条件下使所述脱靶杂交探针与所述核酸文库接触；在所述靶物特异性杂交探针与所述靶序列杂交的条件下使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触；从所述核酸文库中选择与所述靶物特异性杂交探针结合的一组核酸片段；并且对与所述靶物特异性杂交探针结合的所述一组核酸片段测序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.07 US 62/238,411;2016.10.05 US 15/286,3741.降低靶向测序反应中的脱靶捕捉的方法，其包括：提供一组脱靶杂交探针，其特异性结合存在于从样品产生的核酸文库中的多个脱靶序列，所述核酸文库包含多个核酸片段；提供一组靶物特异性杂交探针，其特异性结合存在于所述核酸文库中的多个靶序列；在所述脱靶杂交探针与所述脱靶序列杂交的条件下使所述脱靶杂交探针与所述核酸文库接触；在所述靶物特异性杂交探针与所述靶序列杂交的条件下使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触；从所述核酸文库中选择与所述靶物特异性杂交探针结合的一组核酸片段；并且对与所述靶物特异性杂交探针结合的所述一组核酸片段测序。2.权利要求1的方法，其包括不对与所述脱靶杂交探针结合的不同组的核酸片段测序。3.权利要求1的方法，其包括在所述选择后对所述不同组的核酸片段测序，并提供所述不同组的测序数据以测定所述靶物特异性杂交探针或所述脱靶杂交探针之一或两者的质量度量(qualitymetric)。4.权利要求1的方法，其中所述核酸文库包含基因组DNA片段，并且所述脱靶杂交探针对鉴定为脱靶序列的基因组序列是特异性的。5.权利要求4的方法，其中所述基因组DNA片段源自人基因组DNA。6.权利要求1的方法，其中在存在全局杂交封闭剂(globalhybridizationblocker)的情况下进行使所述脱靶杂交探针与所述核酸文库接触或使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触之一或两者。7.权利要求6的方法，其中所述全局杂交封闭剂包含Cot1DNA、tRNA、鲑鱼精DNA、聚(dIdC)和靶向文库片段的通用衔接头的封闭剂中的一种或多种。8.权利要求1的方法，其中所述脱靶杂交探针对脱靶序列是特异性的，所述脱靶序列通过评估与所述靶物特异性杂交探针接触的参照核酸文库的脱靶序列数据鉴定。9.权利要求1的方法，其中同时进行使所述脱靶杂交探针与所述核酸文库接触以及使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触。10.权利要求1的方法，其中在使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触之前进行使所述脱靶杂交探针与所述核酸文库接触。11.权利要求10的方法，其中从所述核酸文库中选择与所述靶物特异性杂交探针结合的所述一组核酸片段包括在使所述靶物特异性杂交探针与所述核酸文库接触之前除去与所述脱靶杂交探针结合的核酸片段。12.权利要求1的方法，其中所述脱靶杂交探针是5’未修饰的并且所述靶物特异性杂交探针是5’生物素化的。13.权利要求1的方法，其中所述脱靶杂交探针和所述靶物特异性杂交探针是5’生物素化的。14.权利要求1的方法，其中选择所述组包括使用结合所述脱靶杂交探针或所述靶物特异性杂交探针之一或两者的链霉亲合素珠。15.权利要求1的方法，其中所述靶物特异性杂交探针对外显子序列是特异性的，并且所述脱靶杂交探针对内含子序列或基因间序列之一或两者是特异性的。16.权利要求1的方法，其中所述靶物特异性杂交探针包含对第一数目的不同靶序列特异性的多个探针，其中所述脱靶杂交探针包含对第二数目的不同脱靶杂交序列特异性的多个探针，并且其中所述第一数目大于所述第二数目。17.权利要求16的方法，其中经由用户规定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕莉，谢嘉凌，C林，庄涵宇，
申请(专利权)人：亿明达股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US