基因突变检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，提供了一种基因突变检测方法，包括针对待测序样本，制备测序反应体系，所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链；所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；将所述测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序位点进行基因检测。本发明专利技术的基因突变检测方法，提高了测序效率；在同一体系中同时对多个待测序样本进行测序时，无需在额外添加测序引物，避免了测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序效率和准确性。

Gene mutation detection method

The invention relates to the field of molecular biology and provides a method for detecting gene mutation, including preparing a sequencing reaction system for a sample to be sequenced. The sequencing reaction system comprises a template chain and a sequencing primer chain connected at one end on the same solid phase carrier; the sequencing primer chain includes a sequence primer sequence and a sequencing primer chain. The sequence connection sequence is located at the fixed end of the sequence primer chain, the sequence primer sequence is located at the free end of the sequence primer chain, and acts as the sequence primer of the template chain to be tested; the sequence primer sequence is anchored on the template chain to be measured, and the sequence site on the template chain to be sequenced is treated as the base. Because of testing. The gene mutation detection method of the invention improves the sequencing efficiency; when sequencing a plurality of samples to be sequenced simultaneously in the same system, no additional sequencing primers are added, thus avoiding the mutual interference caused by different sequencing primers and improving the sequencing efficiency and accuracy.

【技术实现步骤摘要】
基因突变检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基因突变检测方法。
技术介绍
基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。针对基因突变的检测，二代高通量测序技术因其准确、灵敏的特性，应用范围不断扩大，已涉及生命科学研究以及医学研究的各个不同方面，利用二代高通量测序技术来进行基因突变检测也是目前的研究热点之一。但是，基于二代高通量测序技术的基因突变检测方法，当同时对多个待测序样本进行检测时，需要向测序体系中加入多种测序引物，不同测序引物之间容易产生相互干扰，使得多位点测序准确性降低，从而可能降低基因突变检测的准确率。因此，需要一种新的基因突变检测方法，能够避免在同一体系中同时对多个待测序位点进行检测时，不同测序引物之间相互干扰的现象。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因突变检测方法，旨在解决现有技术在同一体系中同时对多个待测序位点检测时，不同测序引物之间相互干扰的问题。一种基因突变检测方法，包括以下步骤：S1、制备测序反应体系，所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链；所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；S2、将所述测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序位点进行基因检测。优选的，所述固相载体表面上，待测模板链的密度为5至10pmol/cm2；所述测序引物链的密度为5至10pmol/cm2。优选的，所述测序引物链的长度为75至150bp。优选的，所述测序连接序列为(dN)x，其中，N为A、T、C或G，60≤x≤135。优选的，当所述待测序样本有多个时，根据待测序样本的不同分别制备测序反应体系，再将多个测序反应体系混合后进行基因检测。优选的，所述步骤S1包括以下步骤：S11、采用扩增引物组对含待测序位点的核酸片段进行PCR扩增，得扩增产物；S12、在扩增产物一端连接接头一，得测序连接产物；S13、所述接头一在与扩增产物连接端的相对端上含有第一配对基团，所述测序连接产物通过第一配对基团连接在固相载体上；所述固相载体上还连接有测序引物链，所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；S14、洗脱去除固相载体上测序连接产物中的一条单链，得测序反应体系。优选的，所述扩增引物组的一条扩增引物中含有切割位点，所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点，所述步骤S12包括以下步骤：S121、采用特异性切割酶对扩增产物进行酶切，得第一酶切产物；所述第一酶切产物上形成第一粘性末端，所述特异性切割酶为特异性切割尿嘧啶的酶或限制性内切酶；S122、在第一酶切产物上连接接头一，得测序连接产物；所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。优选的，所述步骤S122包括以下步骤：S1221、在第一酶切产物上连接接头一，得第一连接产物；所述接头一上含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端，所述接头一上还含有ⅡS型限制性内切酶识别序列，在第一连接产物中，所述待测序位点位于所述ⅡS型限制性内切酶识别序列和形成的ⅡS型限制性内切酶切割位点之间，所述待测序位点与所述ⅡS型限制性内切酶切割位点之间的距离为1至5bp；S1222、采用ⅡS型限制性内切酶对第一连接产物进行酶切，得第二酶切产物，所述第二酶切产物上形成第三粘性末端；S1223、在第二酶切产物上连接接头二，得测序连接产物；所述接头二上含有与第三粘性末端完全互补配对的第四粘性末端，且所述接头二上含有用于测序引物序列锚定的引物锚定序列。优选的，所述扩增引物组的一条扩增引物上含有ⅡS型限制性内切酶识别序列；在扩增产物上形成的ⅡS型限制性内切酶切割位点位于所述ⅡS型限制性内切酶识别序列和所述待测序位点之间，且所述ⅡS型限制性内切酶切割位点与待测序位点的距离为1至5bp，步骤S12包括以下步骤：S121’、采用相应的ⅡS型限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得含待测序位点的第一酶切产物，所述第一酶切产物上经酶切形成第一粘性末端；S122’、在第一酶切产物上连接接头一，得测序连接产物，所述接头一上含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端，所述接头一上还含有用于测序引物序列锚定的引物锚定序列。优选的，所述扩增引物组的一条扩增引物上含有切割位点和ⅡS型限制性内切酶识别序列，所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点；在扩增产物中，所述待测序位点位于所述ⅡS型限制性内切酶识别序列和形成的ⅡS型限制性内切酶切割位点之间，且所述待测序位点与所述ⅡS型限制性内切酶切割位点之间的距离为1至5bp，步骤S12包括以下步骤：S121’’、采用特异性切割酶和ⅡS型限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得含待测序位点的第一酶切产物，所述第一酶切产物上经特异性切割酶酶切形成第一粘性末端，经ⅡS型限制性内切酶酶切形成第三粘性末端；所述特异性切割酶为特异性切割尿嘧啶的酶或限制性内切酶；S122’’、在第一酶切产物上分别连接接头一和接头二，得测序连接产物；所述接头一上含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端，所述接头二上含有与第三粘性末端完全互补配对的第四粘性末端，所述接头二上还含有用于测序引物序列锚定的引物锚定序列。本专利技术的基因突变检测方法，将待测模板链和测序引物序列固定在同一固相载体上，通过对测序反应体系的制备能够获得均匀分布的待测模板链和测序引物链，提高了后续测序过程中的测序引物序列的锚定效率，进而提高了测序效率；且当在同一体系中对多个待测序样本进行测序时，无需在测序步骤中额外添加测序引物，避免了由于测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序效率和准确性；通过在扩增引物上设计切割位点，可以提高接头和扩增产物的连接效率；通过在扩增引物或接头上设计ⅡS型限制性内切酶识别序列，可以控制待测序位点和引物锚定序列之间的距离，从而可以只需进行较少次数的测序步骤即可完成检测，大大缩短了测序时间，且使对待测序位点的检测不受测序仪器读长的限制，提高了测序准确性。附图说明图1为本专利技术第一实施例中测序反应体系的结构示意图。图2为待测模板链和测序引物链均通过5’端连接在固相载体上的结构示意图。图3为待测模板链通过5’端、测序引物链通过3’端连接在固相载体上的结构示意图。图4为待测模板链通过3’端、测序引物链通过5’端连接在固相载体上的结构示意图。图5为待测模板链和测序引物链均通过3’端连接在固相载体上的结构示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术第一实施例提出一种基因突变检测方法，包括以下步骤：S1、针对待测序样本，制备测序反应体系，如图1所示，所述反应体系包括一端连接在同一固相载体110上的待测模板链120和测序引物链130；所述测序引物链130包括测序引物序列131和测序连接序列132；所述测序连接序列132位于所述测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、针对待测序样本，制备测序反应体系，所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链；所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；S2、将所述测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序位点进行基因检测。

【技术特征摘要】
1.一种基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、针对待测序样本，制备测序反应体系，所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链；所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；S2、将所述测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序位点进行基因检测。2.根据权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述固相载体表面上，待测模板链的密度为5至10pmol/cm2；所述测序引物链的密度为5至10pmol/cm2。3.根据权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述测序引物链的长度为75至150bp。4.根据权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，当所述待测序样本有多个时，根据待测序样本的不同分别制备测序反应体系，再将多个测序反应体系混合后进行基因检测。5.根据权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述测序连接序列为(dN)x，其中，N为A、T、C或G，60≤x≤135。6.根据权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：S11、采用扩增引物组对含待测序位点的核酸片段进行PCR扩增，得扩增产物；S12、在扩增产物一端连接接头一，得测序连接产物；S13、所述接头一在与扩增产物连接端的相对端上含有第一配对基团，所述测序连接产物通过第一配对基团连接在固相载体上；所述固相载体上还连接有测序引物链，所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；S14、洗脱去除固相载体上测序连接产物中的一条单链，得测序反应体系。7.根据权利要求6所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述扩增引物组的一条扩增引物中含有切割位点，所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点，所述步骤S12包括以下步骤：S121、采用特异性切割酶对扩增产物进行酶切，得第一酶切产物；所述第一酶切产物上形成第一粘性末端，所述特异性切割酶为特异性切割尿嘧啶的酶或限制性内切酶；S122、在第一酶切产物上连接接头一，得测序连接产物；所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。8.根据权利要求7所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤S122包括以下步骤：S122...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，黄思强，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44