一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法及细菌鉴定试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法及试剂盒，该方法包括步骤：选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化其基因组DNA；PCR扩增纯化后的基因组DNA的特征序列片段；提取和纯化PCR扩增产物；测定纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；将相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；其中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵进行菌体破碎；采用苯酚‑氯仿‑异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。本发明专利技术可为细菌核酸测序鉴定方法提供客观、准确的判定依据，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定。

A method for sequencing and identification of bacterial nucleic acids based on DNA characteristic sequence and bacterial identification Kit

The invention relates to a bacterial nucleic acid sequencing identification method and kit based on DNA characteristic sequence. The method comprises the following steps: selecting the bacterial strain to be identified, extracting and purifying its genomic DNA; amplifying and purifying the characteristic sequence fragments of the purified genomic DNA by PCR; extracting and purifying the PCR amplified products; determining the purified PCR amplified products. The sequence of the amplified product was sequenced by universal sequence splicing software to remove the primer region and obtain the DNA sequence of the corresponding fragment. The DNA sequence of the corresponding fragment was imported into the standard nucleic acid sequence database for sequence alignment and bacterial strain identification. The genomic DNA of the strain was extracted and purified by lysozyme and dodecane. Sodium bisulfate and hexadecyl trimethyl ammonium bromide were used to break the bacteria, and phenol chloroform isoamyl alcohol and ethanol were used to precipitate nucleic acid to obtain genomic DNA which met the quality control requirements. The invention can provide objective and accurate judgment basis for bacterial nucleic acid sequencing identification method, and realize rapid and integrated identification of bacterial pollutants.

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法及细菌鉴定试剂盒
本专利技术涉及核酸测序鉴定方法，尤其涉及一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法及细菌鉴定试剂盒。
技术介绍
利用分子生物学技术对药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中的污染微生物进行鉴定、分类和追溯，是加强药品生产过程质量控制、提升产品质量与安全性、降低用药风险的有效手段。与传统的形态学观察、显微镜检、理化鉴别和生化分析等技术相比，分子生物学技术以生物核酸作为目标检测物，可以从根本性的遗传物质层面对菌株的种属及来源做出解释，检测结果更加准确，灵敏度更高，特异性更强，目前已逐渐成为国、内外药品质量标准发展的必然趋势。目前，《美国药典》(USP40<1113>)、《欧洲药典》(EP9.0<5.1.6>)、《日本药典》(JP17<GeneralInformationG4>)、《中国药典》(通则9204)中均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节。DNA特征序列(DNA条形码)分子鉴定是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的分子生物学分类方法。该方法以核酸测序技术为基础，通过筛选通用DNA特征序列，建立数据库和鉴定平台，运用生物信息学方法分析比对DNA数据，进而对物种进行鉴定，是对传统生物鉴定方法的有效补充和重大突破，近年来受到国内外药品质量标准制定机构的广泛关注，并逐渐成为物种鉴定和分类的研究热点。16SrRNA基因全长涵盖了最全面的菌株遗传进化信息，但受到核酸测序方法操作性、测序质量、测序成本、核酸测序反应长度、特别是高通量核酸测序反应读长的限制，多数文献报道还是采用部分核酸序列(PartialSequence)进行研究，具有鉴定和分类意义的核心区域尚待讨论，如：USP40<1113>中认为16SrRNA基因5'端对于细菌“种”水平的鉴定更具有意义；Chan等研究报道在临床分离微生物的种群鉴定时，V1～V2区更具有分类意义；Kataoka等在链霉素分类鉴定中采用V1～V3区作为鉴定靶点；Becker等在葡萄球菌分类鉴定中采用V1～V3区和V1～V8区的比较方法；Engelbrektson等利用Roche454核酸测序平台研究发现V1、V2和V8区具有更多的特异性位点；Kim等借助OTUs(Operationaltaxonomicunits)分析的理论，认为V1～V3区和V1～V4区在微生物菌群鉴定中更有分类意义；Chakravorty等研究发现16SrRNA中V2、V3、V6区核酸序列串联可实现多数细菌“种”水平的鉴定和分类；Lu等利用PCR和RFLP方法对于临床脑脊液分离的微生物菌群进行了分类鉴定，认为16SrRNA中V4～V9区分辨率较低等。目前，以16SrRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道；以16SrRNA核酸测序方法进行微生物鉴定的文献中，所选取的测序靶点和测序引物各异，符合药品质量控制要求的具有鉴定和分类意义的DNA特征序列片段尚不清晰明确；现有研究中的核酸测序结果多数是通过Blast分析法与Genebank数据库中的核酸序列进行比对，对于测序结果的质量核查和Genebank数据库中序列信息的准确性关注度较小，测序结果的判定依据尚不规范统一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，通过测定16S核糖体RNA基因5'端可变区的核酸序列进行菌株鉴定，提供一种简便、快速、规范化的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，并在此基础上提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：本专利技术的第一个目的是一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其包括如下步骤：步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶(Lysozyme)、十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate，SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CetyltriethylammnoniumBromide，CTAB)进行菌体破碎；采用苯酚-氯仿-异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。为了进一步优化上述细菌核酸测序鉴定方法，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/mL～20mg/ml溶菌酶、5％～10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％～10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。更进一步地，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者10mg/ml溶菌酶、10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者20mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。最优选地，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml溶菌酶、10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。进一步地，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化包括如下步骤：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入适宜的缓冲液、溶菌酶，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈震荡，室温静置、离心，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入无水乙醇，低温条件下静置，离心、弃去上清液；加入75％乙醇溶液洗涤，离心、弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液。在该步骤中，所述适宜的缓冲液可为本领域使用的常规的任一合适的缓冲液，优选为TE缓冲液。更进一步地，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化(CTAB直接提取法)包括如下步骤：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入TE缓冲液450μl、溶菌酶(10mg/ml～20mg/ml)25μl，混匀，37℃水浴加热30分钟；加入5％～10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液50μl，37℃水浴加热15分钟；加入1％氯化钠溶液80μl、5％～10％(w/v)CTAB溶液70μl，65℃水浴加热15分钟；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，v/v/v)溶液350μl，剧烈震荡，室温静置5分钟，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置不少于30分钟，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液；加入适量75本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵进行菌体破碎；采用苯酚‑氯仿‑异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵进行菌体破碎；采用苯酚-氯仿-异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。2.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml～20mg/ml溶菌酶、5％～10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％～10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。3.根据权利要求2所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者10mg/ml溶菌酶、10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者20mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。4.根据权利要求3所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化包括如下步骤：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入适宜的缓冲液、溶菌酶，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈震荡，室温静置、离心，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入无水乙醇，低温条件下静置，离心、弃去上清液；加入70％乙醇溶液洗涤，离心、弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液。5.根据权利要求3所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化包括如下步骤：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入溶菌酶溶液，混匀、水浴加热；加入十...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯震，蒋波，李芳，洪小栩，许华玉，秦峰，刘浩，杨美成，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海,31