一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。本发明专利技术还提供了所述融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述融合蛋白针对肿瘤抗原良好的特异性和杀伤效果，并对正常组织细胞具有保护作用，具有良好的临床应用前景。

Fusion protein of Pseudomonas aeruginosa exotoxin and its application

The present invention discloses a fusion protein of nano-antibody and Pseudomonas aeruginosa exotoxin. The fusion protein is composed of nano-antibody with targeting effect or its variable region fragment in series with Pseudomonas aeruginosa exotoxin. The invention also provides the application of the fusion protein in the preparation of tumor treatment drugs. The fusion protein has good specificity and killing effect against tumor antigen, and has protective effect on normal tissue cells, and has good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用
本专利技术公开了一种融合蛋白及其免疫学应用，属于多肽
，更具体地，属于免疫球蛋白

技术介绍
肿瘤是严重危害人类健康的重要因素。传统的化疗药物和放疗都具有靶向性差的特点，因此靶向药物的研发已经成为恶性肿瘤治疗的研究热点。最初针对肿瘤细胞的靶向治疗应用的是无标记的单克隆抗体，目的是诱导细胞死亡或者是利用补体介导的细胞毒的作用来杀伤靶细胞，但是癌细胞通常会表现出抗凋亡的功能，而且它也可以将抗原频繁调变来避免上述两种杀伤机制对其造成的损伤。随后又出现了放免治疗技术，它不但可以增加细胞毒性作用，而且还很小程度上依赖抗原抗体特异性结合和诱导细胞死亡的机理；然而该技术仍有很大的毒副作用尤其是表现在骨髓抑制作用上面，由此阻碍了该技术在疾病诊疗中的应用。第三种是抗体药物分子偶联技术(ADC)，通过将毒性小分子偶联到抗体分子上，通过抗体分子的特异性将毒性分子带到肿瘤细胞表面并且内化，释放出毒性分子杀伤肿瘤细胞。这种技术需要寻找具有肿瘤靶向性和内吞作用的抗体及其受体，毒性分子在血液中会脱落而对正常细胞产生毒性，因此其应用有一定的局限性。第四种导向治疗就是目前研究的比较热的重组免疫毒素(Immunotoxins，ITs)技术，该技术的机理是靶细胞将毒素内化后进而发挥毒素的细胞毒作用，而对非靶细胞则没有相应的细胞毒作用。由于毒素分子与抗体是通过连接肽共价结合，在血液中不会脱落，而且毒素分子本身带有跨膜转运的序列，不需要具有内吞作用的抗体及其受体的介导，任何针对细胞膜表面抗原的抗体都可以使用，应用范围广泛。免疫毒素是一种有效的肿瘤导向治疗药物，又称为生物导弹，是一种具有特异性靶细胞杀伤效应的杂合分子，主要由毒素部分与靶向部分组成。它由生物来源的毒素分子与肿瘤特异性抗体或肿瘤细胞表面受体相应的配体偶联而成，通过肿瘤特异性抗体或配体在体内的导向作用，将毒素效应分子定向地带至病灶部位，针对性杀死肿瘤细胞或病变细胞，减少对正常组织的伤害。免疫毒素抑制肿瘤细胞增殖主要通过以下两种方式：一是通过与细胞表面受体结合，经内化使免疫毒素进入细胞，通过抑制癌细胞的蛋白质合成导致细胞死亡或激活重要的凋亡蛋白而导致细胞凋亡；二是毒素蛋白直接作用于细胞膜，使细胞膜通透性增加，导致细胞死亡。ITs的制备中最常用到的毒素有铜绿假单胞杆菌外毒素(PseudomonasexotoxinA，PE)以及白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)等由细菌产生的毒素，还有植物细胞产生的蓖麻毒素(Ricin)、相思子毒素(Abrin)和肥皂草毒素(Saporin)，还有其它细胞产生的毒素如蜜蜂体内产生的蜂毒肽。随着抗体技术和基因工程技术的快速发展，第一代的化学偶联的ITs逐步被第二代的重组ITs所替换，原因是第二代的ITs与第一代的相比具有融合蛋白更稳定，分子量更低以及组织渗透性更好的优势。用PE类毒素研制的ITs具有更高的杀伤效率以及更高的特异性，而且与DT类毒素相比机体内没有预存在抗体等好处，使得重组ITs称为目前应用最广研究最热的肿瘤治疗的技术。当前ITs设计的载体的选择依据无非是受体-配体和抗原-抗体的利用，癌细胞表面会过量表达各种生长因子受体、DC分子和肿瘤标志抗原等。单抗因为能特异性识别与结合肿瘤细胞表面的抗原，所以成为了目前研究领域里最受欢迎的载体分子。然而因其多数是来源于与小鼠体内，而且分子量比较大，不但具有很强的免疫原性还具有很低的穿透性，所以在实际科研和应用中都大大限制了该抗体的发展。为了克服上述缺点，当下制备重组ITs多数采用的分子量比较小的抗体，如单链抗体(scFv)等。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。本专利技术的目的就是提供一种免疫毒素与纳米抗体的融合蛋白，既能充分发挥其靶向药物的作用，并且具有良好的靶向性和通透性，能在发挥对肿瘤细胞的充分毒性杀伤作用的同时避免对正常细胞的损伤，为其在肿瘤临床治疗中的应用奠定基础。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，专利技术人意欲采用基因重组表达的方式，表达纳米抗体和铜绿假单胞杆菌外毒素PE40重组融合蛋白，用于临床靶向治疗。因此，本专利技术首先提供了一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。本专利技术中，将该纳米抗体命名为靶向纳米抗体。在所述靶向纳米抗体和铜绿假单胞杆菌外毒素之间可以添加连接肽以使抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因能够各自表达和形成自身的空间构型，不造成抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因蛋白的空间位阻，都具有相应的生物学活性，连接肽可以是(GGGGS)n柔性多肽，其中，n为1-6的整数，优选地n＝3。在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白还通过连接肽与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联，所述连接肽含有基质金属蛋白酶的作用位点序列。这里所述的铜绿假单胞菌外毒素的配体是指能够与铜绿假单胞菌外毒素特异性结合，从而阻止铜绿假单胞菌外毒素发挥其生物学效应的分子。在一个更为优选的技术方案中，所述铜绿假单胞菌外毒素的配体为抗铜绿假单胞菌外毒素的纳米抗体。本专利技术中，将该纳米抗体命名为保护性纳米抗体。所述靶向纳米抗体或者抗体片段和免疫毒素及其保护性纳米抗体或者抗体片段的融合方式，可以是在靶向抗体片段羧基端融合一个或者几个PE40毒素，在每个PE40毒素的羧基端融合一个或者多个保护性抗体片段。所述保护性抗体片段可以是不同的抗体片段，分别针对同一免疫毒素的不同抗原决定簇。所述靶向抗体片段也可以是一个或者多个不同的抗体片段，分别针对同一抗原的不同抗原决定簇或者不同的抗原分子。在一个优选的技术方案中，所述铜绿假单胞菌外毒素氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联的连接肽中基质金属蛋白酶的作用位点序列如SEQIDNO:2中第1位-第10位氨基酸残基所示。在铜绿假单胞杆菌外毒素基因和保护性抗体片段之间的连接肽中可以添加间隔序列以使保护性抗体抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因能够各自表达和形成自身的空间构型，不造成抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因蛋白的空间位阻，都具有相应的生物学活性，间隔序列可以是(GGGGS)n柔性多肽，其中，n为1-6的整数，优选地n＝3。在一个更为优选的技术方案中，所述融合蛋白与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联的连接肽序列如SEQIDNO:2所示。在一个优选的技术方案中，所述具有靶向作用的纳米抗体为抗肿瘤抗原的纳米抗体。在一个更为优选的技术方案中，所述肿瘤抗原为CEACAM-5。在一个尤为优选的技术方案中，所述抗肿瘤抗原的纳米抗体的可变区序列氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。其次，本专利技术还提供了上述的融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术所述融合蛋白是在DNA水平上将编码靶向抗体或者抗体可变区片段的基因和编码铜绿假单胞菌外毒素的报告基因及其纳米抗体基因融合后，通过重组表达的方法，在如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达的重组融合免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还通过连接肽与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联，所述连接肽含有基质金属蛋白酶的作用位点序列。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述铜绿假单胞菌外毒素的配体为抗铜绿假单胞菌外毒素的纳米抗体。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述铜绿假单胞菌外毒素氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求2所述的融合蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，于建立，刘原源，黄琪，李飞，古一，周宇杭，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44