本发明专利技术涉及一种检测方法，尤其涉及超高效液相色谱‑串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法。本发明专利技术样品分果皮和果肉两部位，经甲醇‑水充分提取处理；采用Accucore XL C18柱(150×4mm，4.6μm)分离，甲醇‑0.15％甲酸水为流动相梯度洗脱，电喷雾离子源正负离子切换多反应监测模式串联质谱下检测，外标法定量。结果表明：九种功能性成分在较宽的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。三个添加量水平的回收率在83.57％～112.91％之间，相对标准偏差均小于在1.58％～8.33％之间(n＝6)。测定了4批次常山胡柚样品，同时测定了其中的九种功能性成分。本方法快速、灵敏、准确，适用于常山胡柚中九种功能性成分的定性和定量检测。
【技术实现步骤摘要】
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法
本专利技术涉及一种检测方法，尤其涉及超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法。
技术介绍
枳壳(zhǐqiào)是《中国药典》收录的草药，药用来源为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳性苦、辛、酸、温，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停；胃下垂，脱肛，子宫脱垂等病症。枳壳在我国多地都有生产，以湖南和江西的产品为佳。其中江西省新干县的枳壳又名商洲枳壳、三湖枳壳，具有“果肉厚，外翻如覆盆，瓤瓣数较多”的特点，其药用的有效成分优于其他品种，被列为中国国家地理标志保护产品。随着对枳壳保健功能的认识逐步加强，对枳壳中所含的主要功能性成分的含量也越来越关注。但枳壳中不同部位的多种功能性成分含量的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定一直未见文献报道。因此，建立枳壳中不同部位的九种功能性成分的分析方法并得到功能成分的含量测定结果，有助于公众更好地了解和应用枳壳的保健功能，也有利于企业和主管部门对功能成分的含量进行有效的跟踪控制，该方法对促进枳壳的开发十分必要。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，该方法操作简便、灵敏度高、结果准确，适用于作为枳壳中不同部位的九种功能性成分的快速筛查和确证的检测手段。为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，其特九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：1)标准溶液的配制精密称取九种功能性成分的标准品10mg，精确至0.1mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/mL的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水＝1∶1(v/v)溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中；2)试样的制备称取1g粉末，加30ml50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率；m:活性物质测定所得质量，mg/g；4)色谱条件色谱柱：ThermoAccucoreXLC18，150×4.6mm，4μ；液相洗脱梯度：A:0.15％甲酸水溶液，B:甲醇；B相变化：0-1.0min:30％；0.5-14min:30％→65％；14-14.01min:65％→95％；14.01-20min:95％；20-20.01min:95％→30％；20.01-22min:30％；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL；5)质谱分析条件电喷雾离子源，正负电离模式，干燥器温度：350℃，电喷雾电压：3500V，扫描方式为多反应监测模式；出峰时间、母离子、子离子、碰撞能和监测模式的质谱条件如下：*为定量离子。本专利技术由于采用了上述的技术方案，九种功能性成分在较宽的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。三个添加量水平的回收率在83.57％～112.91％之间，相对标准偏差均小于在1.58％～8.33％之间(n＝6)。测定了4批次枳壳样品，同时测定了其中的九种功能性成分。本方法快速、灵敏、准确，适用于枳壳中九种功能性成分的定性和定量检测。附图说明图1为流动相对9种活性物质峰面积的影响图。图2为同分异构体的总离子流图(1:柚皮苷；2：芸香柚皮苷；3：新橙皮苷；4：橙皮苷)。图3为提取次数对9种活性物质含量的影响图。图4为提取试剂的浓度对9种活性物质提取所得含量的影响图。图5为料液比对9种活性物质的提取得率的影响图。图6为超声时间对9种活性物质的提取得率的影响图。图7为HPLC-MS/MS色谱图(A:标准品1,圣草次苷；2，芸香柚皮苷；3，柚皮苷；4，橙皮苷；5，新橙皮苷；6，柚皮素；7，柠檬苦素；8，橙皮素；9，诺米林；B:衢州枳壳样品)。具体实施方式1实验部分1.1仪器与试剂TSQvantage三重四级杆串联液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；高速粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)；KQ-500B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；MultifugeX1R高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)。标准品：橙皮苷(CAS:520-26-3，纯度:97.06％)，新橙皮苷(CAS:13241-33-3，纯度：98.76％)，橙皮素(CAS:520-33-2，纯度：98.45％)，柚皮苷(CAS:10236-47-2，纯度：99.33％)，芸香柚皮苷(CAS:14259-46-2，纯度:99.38％)，柚皮素(CAS:480-41-1，纯度：98.09％)，柠檬苦素(CAS:1180-71-8，纯度：99.08％)，诺米林(CAS:1063-77-0，纯度：99.32％)，圣草次苷(CAS:13463-28-0，纯度：98.16％)均购自上海安谱实验科技股份有限公司。枳壳样品来源信息见表1。表1枳壳样品来源1.2测定方法1.2.1色谱条件色谱柱：ThermoAccucoreXLC18，150×4.6mm，4μ；液相洗脱梯度：A:0.15％甲酸水溶液，B:甲醇。B相变化：0-1.0min:30％；0.5-14min:30％→65％；14-14.01min:65％→95％；14.01-20min:95％；20-20.01min:95％→30％；20.01-22min:30％。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL。1.2.2质谱条件电喷雾(ESI)离子源，正负电离模式，干燥器温度：350℃，电喷雾电压：3500V，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，各活性物质的质谱参数见表2。表29种活性物质的出峰时间及质谱参数标*号的是定量离子。1.2.3提取方法优化1.2.3.1提取次数优化称取1g粉末，加30ml50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率。m:活性物质测定所得质量，mg/g1.2.3.2提取试剂浓度优化设置5个的提取试剂的浓度梯度，40％、50％、60％、70％、80％甲醇水，称取1g粉末，分别加30mL不同浓度的甲醇水溶液于50mL离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm有机系滤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.超高效液相色谱‑串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，其特征在于，九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：1)标准溶液的配制精密称取九种功能性成分的标准品10mg，精确至0.1mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/mL的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水＝1∶1(v/v)溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中；2)试样的制备称取1g粉末，加30ml 50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率；
【技术特征摘要】
1.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，其特征在于，九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：1)标准溶液的配制精密称取九种功能性成分的标准品10mg，精确至0.1mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/mL的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水＝1∶1(v/v)溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中；2)试样的制备称取1g粉末，加30ml50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷美康，徐思绮，彭芳，祝子铜，徐佳文，
申请(专利权)人：衢州出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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