一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用技术

本发明专利技术属于精细化工技术领域，具体涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用，所述探针以双氰基二苯乙烯为母体制备，结构中包含咔唑基、双氰基、正辛基。该探针的分子结构中由于含有较长的柔性链，具有较强的亲脂性，能穿透细胞壁(或细胞膜)进入细胞，对细胞进行染色，从而检测细胞中的pH；并且属于D‑π‑A型分子，提高了双光子吸收截面(δ)，使探针具有较高的成像清晰度与分辨率；另外在标记过程中拥有超大斯托克斯位移，大大提高了成像准确度与精密度，并且本发明专利技术探针在溶剂中荧光量子产率(Φ)较高，双光子发射截面较大，则成像的亮度越高，自然越清晰、分辨率也越高。

Preparation of a two-photon fluorescent pH probe and its application in cell imaging

The invention belongs to the field of fine chemical technology, in particular relates to a preparation method of two-photon fluorescent pH probe and its application in cell imaging. The probe is prepared with dicyanodistilbene as the parent material and contains carbazole group, dicyano group and n-octyl group in the structure. Because of its long flexible chain and strong lipophilicity, the probe can penetrate the cell wall (or cell membrane) into the cell and stain the cell so as to detect the pH value in the cell. In addition, it has a super Stokes shift in the labeling process, which greatly improves the imaging accuracy and precision. Moreover, the fluorescence quantum yield (_) of the probe in the solvent is higher, and the two-photon emission cross section is larger, the brightness of the imaging is higher, the clearer and the higher the resolution is.

【技术实现步骤摘要】
一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用
本专利技术涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用。
技术介绍
细胞内的大多数活动都是pH敏感的，包括细胞体积调节、囊泡运输、细胞极化、纤维收缩以及支架的建立。细胞内的pH的改变会影响细胞内的信号传递分子，如Ca2+、cAMP的活动，因此影响细胞内信号的传导。细胞内pH值的测定方法主要有弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法，以及目前广泛应用的免疫荧光探针法等。荧光探针技术经过不断的发展，目前趋于较为成熟，pH值荧光染料有很多种，每种染料又有不同的工作pH区间，广泛采用的有BCECF荧光黄探针和SNARF-1羧化半萘罗丹明类荧光探针。但BCECF法不能用于细胞膜电位的测定，且其在细胞质中更易螯合，增加了染料的浪费和增大了实验误差；SNARF法的实验精度还需要再进一步提高。本专利技术人一直致力于对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究，在前期的研究过程中，专利CN200710010784.6、一类双氰基二苯乙烯双光子荧光染料公开了对通用的二苯乙烯类染料结构进行修饰改造合成新型双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料，具体表现为在通用的二苯乙烯染料的同一苯环上引入双氰基，并在说明书中针对双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料中代表性化合物的合成方法、使用方法进行了披露。但是，在当时的研究过程中，仅是对该类染料测定溶液粘度、温度、极性变化的方法，以及典型化合物D1-1、D3-1的上述测定结果进行了披露，但其他结构染料的性能及应用并未具体涉及，还需要进一步的验证；同时该专利也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面探测的应用。另外，论文《对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究》也是同一时期针对双氰基二苯乙烯类染料及探针研究的阶段性成果，文中公开了对D-π-A、A-π-A、A-A-A、D-A-D等结构的二苯乙烯类染料的双光子吸收截面、溶解性影响、光物理性质的影响等内容，但也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面检测探针的应用。在现有技术中，CN201610801435.5(专利1)公开了一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，该探针基于双通道检测线粒体中的pH水平，并很好地穿透组织，定位于线粒体中；CN201310326493.3(专利2)公开了一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用，所述探针化合物的双光子吸收截面强，水溶性好，并具有较高的反应活性和很强的配位能力，可应用在银离子检测和pH检测中；但是，专利1涉及的探针最大发射波长仅456nm，离理想的近红外成像窗口(650-900nm)差距较大，这会给细胞带来光致毒，还会诱导组织自发荧光干扰(短波长长的发射光成为组织中生物荧光分子的激发光)；此外，专利1涉及的探针的荧光量子产率才0.02，这会严重影响检测的灵敏度与成像的清晰度与分辨率。专利2涉及的探针分子体积较大，细胞渗透性严重受影响，专利内容亦未提及用于细胞成像，应该是细胞成像比较困难；另外专利2涉及的探针虽未测定双光子吸收截面，从分子结构可以估计双光子吸收截面不是很大，应该远小本专利技术的探针的双光子吸收截面；专利2涉及的探针还会受银离子的干扰。因此，研究出适合于细胞内pH水平检测，并且探针使用量少、毒性极低、实现对细胞酸碱度分布的监测并进一步辅助相应疾病和病理的研究，是本领域人员需要不断去探索和创造的内容。而本专利技术研究人员此前在对双氰基二苯代乙烯双光子荧光染料的研究过程中，侧重于代号为D1-1、D3-1的化合物探针在溶剂极性测定、微粘度测定、环境温度测定、固体硬度检测方面的研究(见专利技术专利申请CN200710010784.6)，对该类双氰基二苯代乙烯双光子荧光探针的研究过程中，针对细胞内汞离子、锌离子、银离子的检测，细胞内糖链抗原的活性检测以及温度传感检测等方面均进行了研究和报道，但基于双氰基二苯代乙烯的含有长柔性集团的D1化合物，用于细胞内pH检测与成像的专利技术未见报道。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种适用于细胞pH水平检测用的双光子荧光探针，该探针拥有大的双光子吸收截面(δ)和长柔性基团，故而具有较强的亲脂性，较高的成像清晰度与分辨率、准确度与精密度，并且能提高探针的使用效率。具体来说，本专利技术提供了如下的技术方案：一种双光子荧光pH探针D1，具有以下分子结构：所述的双光子荧光pH探针D1的合成路线如下所示：进一步的，所述探针D1的制备方法包括以下步骤：(1)按常规方法合成中间体2、3、4、5和6；(2)中间体7的合成：称取5g咔唑、3g氢氧化钾，加入盛有30mLDMSO的干燥单口烧瓶中，量取4mL1－溴辛烷置于恒压滴液漏斗中，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；将烧瓶置于80～85℃的油浴中，搅拌下滴入1－溴辛烷，反应2.5-3.5h，冷却后加入100～120mL蒸馏水混合；静置后析出淡黄色固体，过滤，干燥；用无水乙醇重结晶，得白色针状晶体，即中间体7备用；(3)中间体8的合成：量取6mL干燥的DMF置于干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，再将5mL三氯氧磷滴入单口烧瓶；称取9-辛基咔唑4g溶于40ml氯苯，置于恒压滴液漏斗，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；0.5～1h后，将9-辛基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在70～75℃的油浴中搅拌反应5～8h；反应完毕后，冷却，用碳酸氢钠调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇重结晶，得白色晶体，即中间体8备用；(4)目标化合物D1的合成：称取446mg步骤(2)获得的中间体8和30mg氢化钠置于干燥单口烧瓶中，称取292mg中间体5溶于10mL四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光的条件下，将中间体5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中，滴加时间40～50min；滴加完毕后，室温搅拌反应24h，反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提3～4次，每次15mL，然后水洗2～3次每次10mL，加无水硫酸镁干燥；干燥后过滤，真空脱除溶剂，粗品经硅胶柱色谱分离，其中洗脱液：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12:1，得黄色粉末即为D1。如前所述的双光子荧光标记探针D1，应用于探测细胞内pH水平、细胞异常信息。所述的细胞为成纤维细胞。所述的双光子荧光pH探针，其应用方法是：将D1溶于生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油组成的混合溶液(简称MIS溶液)中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在培养小鼠成纤维细胞后的培养基中加入1μmol·L-1荧光探针，并在30-40℃、含2-10％CO2的细胞培养箱中孵化20-50min，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，并于无色血清游离介质中再孵化10-20min，然后用共聚焦激光扫描显微镜(λex＝800nm,～1.5W)、20倍目镜将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞pH水平，实现对细胞是否异常的监测。其中，所述生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油(CrEL)的体积比为20：35：30：15。其中，小鼠成纤维细胞的培养方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双光子荧光pH探针，其特征在于：所述探针D1具有以下分子结构：

【技术特征摘要】
1.一种双光子荧光pH探针，其特征在于：所述探针D1具有以下分子结构：2.一种如权利要求1所述的双光子荧光pH探针D1的制备方法，其特征在于：合成路线如下所示：3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)按常规方法合成中间体2、3、4、5和6；(2)中间体7的合成：称取5g咔唑、3g氢氧化钾，加入盛有30mLDMSO的干燥单口烧瓶中，量取4mL1－溴辛烷置于恒压滴液漏斗中，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；将烧瓶置于80～85℃的油浴中，搅拌下滴入1－溴辛烷，反应2.5-3.5h，冷却后加入100～120mL蒸馏水混合；静置后析出淡黄色固体，过滤，干燥；用无水乙醇重结晶，得白色针状晶体，即中间体7备用；(3)中间体8的合成：量取6mL干燥的DMF置于干燥的单口烧瓶中，将单口烧瓶置于冰水浴中，再将5mL三氯氧磷滴入单口烧瓶；称取9-辛基咔唑4g溶于40ml氯苯，置于恒压滴液漏斗，于烧瓶上装上恒压滴液漏斗；0.5～1h后，将9-辛基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶，在70～75℃的油浴中搅拌反应5～8h；反应完毕后，冷却，用碳酸氢钠调pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，无水乙醇重结晶，得白色晶体，即中间体8备用；(4)目标化合物D1的合成：称取1mmol步骤(2)获得的中间体8和1.25mmol氢化钠置于干燥单口烧瓶中，称取1mmol中间体5溶于10mL四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄池宝，
申请(专利权)人：遵义师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52