靶向BCMA的嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及靶向BCMA(J22.9)‑tEGFR‑aPD1的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗BCMA单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区和人tEGFR的编码序列和抗人PD1单链抗体的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。

Chimeric antigen receptor targeting BCMA and double modification method and application thereof

The present invention relates to chimeric antigen receptor targeting BCMA (J22.9) tEGFR tEGFR aPD1 and its use. Specifically, the present invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) a coding sequence containing sequentially linked anti-BCMA scFs, a coding sequence of human CD8a hinge region, a coding sequence of human CD8 transmembrane region, a coding sequence of human 41BB intracellular region and human tEGFR, and a coding sequence of anti-human PD1 scFs; and (2) (1) the polynucleotide sequence described above. Complementary sequences of nucleotide sequences. The invention also provides related fusion proteins, carriers containing the coding sequence, and uses of the fusion proteins, coding sequences and carriers.

【技术实现步骤摘要】
靶向BCMA的嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法及其用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向BCMA(J22.9)-BBz-tEGFR-aPD1的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
多发性骨髓瘤是一种恶性浆细胞疾病，表现为骨髓浆细胞恶性克隆性增生，分泌单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，导致骨骼、肾脏等相关靶器官或组织损伤，常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染等[NEnglJMed.2011.364(11):p.1046-60.]。目前多发性骨髓瘤为血液系统第二大恶性肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的10％，多发病于男性，其发病率随着年龄的增长逐年增高，近几年更是有年轻化的趋势[CACancerJClin.2014.64(1):p.9-29.]。B细胞成熟抗原(B-cellmaturationantigen，BCMA)，又称CD269，由184个氨基酸残基组成，其胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域为B细胞表面分子。BCMA属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白，是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)一员，它可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体(aproliferationinducedligand，APRIL)两种配体相结合[CurrOpinStructBiol.2004.14(2):p.154-60.]。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，BCMA基因剔除小鼠免疫系统表现正常，有正常的脾结构，B淋巴细胞的发育正常，但浆细胞数量明显减少，证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，其机制主要包括BCMA与BAFF蛋白结合，并上调抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，维持细胞生长[JExpMed.2004.199(1):p.91-8.]。同样地，该机制也在骨髓瘤细胞中发挥了功能，对骨髓瘤细胞的恶性增生起了重要的促进作用[Blood.2004.103(8):p.3148-57.]。研究表明，BCMA普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系，在多发性骨髓瘤患者中的检测也得到了一致性的结果[Blood.2004.103(2):p.689-94.]。Kochenderfer等在已有报道的基础上，又联合应用Q-PCR、FlowCytometry和免疫组化方法深入研究了BCMA的表达特征，确认BCMA在成熟B细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在CD34+造血细胞中也无表达[ClinCancerRes.2013.19(8):p.2048-60.]。结合BCMA表达特征与CD19的高度相似性，以及抗CD19CART细胞治疗的成功进展，提示我们BCMA可以作为CAR-T细胞的靶点之一用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。2015年9月，CarlJune研究小组在医学界的顶级期刊新英格兰杂志发表了使用CD19分子靶向CAR-T细胞疗法成功治疗1例复发难治多发性骨髓瘤(MM)患者的文章[NEnglJMed,2015.373(11):p.1040-7.]。虽然多发性骨髓瘤作为B细胞系肿瘤通常不表达CD19，因此CD19不作为多发性骨髓瘤免疫治疗的靶标。有报道指出微量的具有耐药性及疾病复发特性的多发性骨髓瘤克隆，具有B细胞表型(即CD19阳性)。在明确BCMA可作为CART细胞的靶点后，美国国家癌症研究院Kochenderfer等成功构建了抗BCMACART细胞，并在临床前研究表明该CART细胞特异性地识别BCMA，并在被BCMA激活后大量扩增、分泌细胞因子并发挥杀伤功能，在小鼠成瘤模型中也具有抗肿瘤效应[ClinCancerRes.2013.19(8):p.2048-60.]。2014年美国国家癌症研究院开展抗BCMACART细胞治疗多发性骨髓瘤的I期临床研究，针对现今标准治疗方案无反应的多发性骨髓瘤患者，验证抗BCMACART细胞的临床安全性和有效性(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT02215967)。在2015年12月初的第57届美国血液年会上，美国国家癌症研究院医学肿瘤科SyedAbbasAli教授团队报告了多发性骨髓瘤患者CAR-T细胞治疗I期临床试验结果。该研究共纳入了12例3线以上化疗失败的难治复发多发性骨髓瘤患者，有的患者骨髓中骨髓瘤细胞≥50％。这些患者输入BCMACAR-T细胞后，1例患者完全缓解，3例患者部分缓解，其余均病情稳定，由此第一次证明抗BCMACAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤有效，且无重大副作用，被评为ASH年度最具影响力的临床研究之一(Late-BreakingAbstracts，大会摘要号：LAB-1)。目前，艾森布拉姆宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心也已注册了抗BCMACART细胞治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验，并在紧锣密鼓的研究开展中(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT02546167)。BCMA-J22.9抗体为人-鼠嵌合抗体，作为靶向多发性骨髓瘤(MM)免疫治疗的一个靶标,此高亲和力的抗体阻断了BCMA与天然配体B细胞激活因子(Bcellactivatingfactor,BAFF)或增殖诱导配体(aproliferationinducedligand，APRIL)的结合。此抗体识别BCMA的氨基酸残基是6位-41位。实验结果显示此抗体在Elisa和流式检测等实验都具有很好的特异性。体内实验的结果显示腹腔注射BCMA-J22.9抗体减轻了小鼠的肿瘤负荷并显著延长了其生存期。BCMA-J22.9嵌合抗体治疗不仅局限于多发性骨髓瘤的治疗(MM),由于BCMA也是治疗自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎的免疫靶标。[MolOncol.2015Aug；9(7):1348-58.]PD1(programmeddeath1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡1受体。PD1受体表达于T细胞表面和初级B细胞表面，在这些细胞的分化和凋亡中发挥作用。PD1有两个配体，分别是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：(1)含有依次连接的抗BCMA单链抗体的编码氨基酸序列、人CD8α铰链区的编码氨基酸序列、人CD8跨膜区的编码氨基酸序列、人41BB胞内区的编码氨基酸序列、人CD3ζ胞内区编码氨基酸序列、和人tEGFR的编码氨基酸序列、抗人PD1单链抗体的编码氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：(1)含有依次连接的抗BCMA单链抗体的编码氨基酸序列、人CD8α铰链区的编码氨基酸序列、人CD8跨膜区的编码氨基酸序列、人41BB胞内区的编码氨基酸序列、人CD3ζ胞内区编码氨基酸序列、和人tEGFR的编码氨基酸序列、抗人PD1单链抗体的编码氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。2.如权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列在所述抗BCMA单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-21位氨基酸所示；和/或所述抗BCMA单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第22-128位氨基酸所示；和/或所述抗BCMA单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第144-263位氨基酸所示；和/或所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第264-310位氨基酸所示；和/或所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第311-332位氨基酸所示；和/或所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第333-380位氨基酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第381-491位氨基酸所示；和/或所述P2A氨基酸序列如SEQIDNO:1第492-517位氨基酸所示；和/或所述GMCSFR信号肽氨基酸序列如SEQIDNO:1第518-539位氨基酸所示；和/或所述的人tEGFR氨基酸序列如SEQIDNO:1第540-874位氨基酸所示。所述抗PD1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第920-1032位氨基酸所示；和/或所述抗PD1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1048-1154位氨基酸所示。3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，在所述抗BCMA单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1-63位核苷酸序列所示；和/或所述抗BCMA单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第64-384位核苷酸序列所示；和/或所述抗BCMA单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第430-789位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:2第790-930位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:2第931-996位核苷酸序列所示；和/或所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第997-1140位核苷酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第1141-1473位核苷酸序列所示；和/或所述人P2A的编码序列如SEQIDNO:2第1474-1551位核苷酸序列所示；和/或所述人GMCSFR的编码序列如SEQIDNO:2第1552-1617位核苷酸序列所示；和/或所述人tEGFR胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第1618-2622位核苷酸序列所示。所述抗PD1单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第2758-3096位核苷酸序列所示；和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31