本发明专利技术公开一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。利用所述几丁质酶BsChi与N‑乙酰葡糖胺酶OfHex1组成复合酶，将两种几丁质降解酶复合使用后，其水解几丁质粗原料生产GlcNAc的效率有了很大提升。经过对该几丁质酶的表达纯化及活性分析后，发现无论是对底物的结合能力还是对复杂底物的水解能力都较一般的几丁质酶有相应的增强。尤其是当二者摩尔比例为(96～99)：(1～4)；酶量达到20μM以上时，水解超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固体几丁质粗底物时能够产生90％的GlcNAc，具有良好的工业化应用前景。
A chitinase from bacteria and its application in the preparation of GlcNAc
The present invention discloses the application of a bacterial source chitinase BsChi in the degradation of solid chitin, and the nucleotide sequence of the gene encoding the chitinase BsChi, as shown by GenBank (AF069131.1). With the compound enzyme of the chitinase BsChi and the N acetyl glucamaminase OfHex1, the two chitin degrading enzymes are used in combination, and the efficiency of the hydrolytic chitin crude raw material to produce GlcNAc has been greatly improved. After the expression, purification and activity analysis of the chitinase, it was found that both the binding ability to the substrate and the ability to hydrolyze the complex substrate were enhanced in comparison with the general chitinase. In particular, when the molar ratio of the two is (96~99) (1~4) and the amount of enzyme is above 20 M, it can produce 90% GlcNAc in the hydrolysis of solid chitin, such as ultramicrocrab powder, Aspergillus niger and shrimp skin powder, and has a good prospect for industrial application.
【技术实现步骤摘要】
一种细菌来源几丁质酶、及其在制备GlcNAc中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效的细菌来源几丁质酶的制备方法及与一种昆虫来源的高效N-乙酰葡糖胺酶的联合应用。
技术介绍
几丁质(chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)为基本单位在自然界大量存在的天然线性直链多糖。几丁质降解后的多种产物如GlcNAc、(GlcNAc)2、几丁寡糖等可用于食品、保健品和化妆品的生产，且研究表明GlcNAc及其衍生物在人体免疫系统、癌症研究中起着很重要的作用。自然界中，几丁质主要存在于节肢动物的外骨骼中，如虾壳、蟹壳，但是传统的化学方法处理这些废弃物得到的副产物种类繁多，其分子大小难以控制、去乙酰化程度不一致，并且化学方法会造成严重的环境污染，所以这些废弃物常常得不到充分的利用。相对于化学方法，利用纯化后的几丁质酶水解几丁质得到的产物比较均一且不会对环境造成污染，是一种应用前景良好的方法。但是就目前的酶法水解而言还存在水解效率低，酶的利用率低等缺点和不足。迫切需要找到高效的几丁质酶来实现几丁质粗底物的工业转化。
技术实现思路
为了提高利用几丁质粗原料生产GlcNAc的效率，本专利技术首先分别提供了两种几丁质降解酶，包括：一种高效的细菌来源几丁质酶和一种昆虫来源的高效N-乙酰葡糖胺酶；在此基础上，本专利技术将所述两个几丁质降解酶进行合理组合使用，发挥了协同作用，在复合酶生产GlcNAc中显示出良好的应用前景。本专利技术公开一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，具体的，编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。经过对该几丁质酶的表达纯化及活性分析后，发现无论是对底物的结合能力还是对复杂底物的水解能力都较一般的几丁质酶有相应的增强。对于上述技术方案中所述的应用，是利用所述几丁质酶BsChi水解固态底物α-几丁质和β-几丁质，例如：含几丁质的生物质，如节肢动物外壳及真菌菌丝体，包括超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固态底物，几丁质酶BsChi的最适温度为30～50℃，最适pH值为5～7。对于上述技术方案中所述的应用，具体的，是即利用所述几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1组成复合酶，将两种几丁质降解酶复合使用后，其水解几丁质粗原料生产GlcNAc的效率有了很大提升。其中，编码所述N-乙酰葡糖胺酶OfHex1基因的核苷酸序列如GenBank(DQ887769.1)所示。进一步研究几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1组成的复合酶的协同应用。结果表明，当二者摩尔比例为(96～99)：(1～4)时；尤其是98.5:1.5的比例下，能够产生最大的协同效果，当二者的酶量达到20μM以上时，水解超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固体几丁质粗底物时能够产生90％的GlcNAc；优选的情况下，二者的酶量达到30μM。对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述的底物先经预处理，所述的固态底物还经过预处理：粉碎至80～150目后，再经蛋白酶处理；所述蛋白酶的主要成分为枯草杆菌Bacilluslicheniformis蛋白酶Carlsberg。对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述粉碎为超微研磨至100目；所用酶为Alcalase2.4LFG蛋白酶，用量为1g酶/50g底物。有益效果：本专利技术所构建表达的细菌几丁质酶BsChi具有比已知公认的细菌高效几丁质酶SmChiA和已经商品化的几丁质酶更好的水解效果，比较(GlcNAc)2的产量，BsChi是SmChiA的1.58倍，是商品化几丁质酶的1.27倍。本专利技术所提出的将几丁质酶和N-乙酰葡糖胺酶协同使用的组合酶法，能够高效的水解固体几丁质产生GlcNAc。使用30μM的复合酶就可以使得GlcNAc的产率达到90％。附图说明图1是几丁质酶BsChi的SDS-PAGE检测结果图，泳道1是空白质粒细菌总蛋白，泳道2是带有目的基因的细菌总蛋白，泳道3是细菌裂解液上清，泳道4是细菌裂解液沉淀，泳道5是纯化的BsChi，泳道6是蛋白标准品；图2是BsChi的酶学特性，图2A图是最适温度曲线，图2B图是最适pH值曲线，图2C图是水解α-几丁质和β-几丁质的进程曲线，图2D图是HPLC的水解产物分析；图3是粗蟹粉经过不同预处理的效果对比；图4是BsChi与SmChiA和商品化几丁质酶的活性对比；图5是复合酶水解能力评价，图5A图是复合酶浓度对产量的影响，图5B图是HPLC分析产物纯度图。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思进行等同替换或改变均属于本专利技术保护范畴。为了方便表述，在以下实施例中，“mM”表示mmol/L；“μM”表示“μmol/L”；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara)；灭菌的条件为121℃下高压灭菌20min。实施例1BsChi酶的制备BsChi的序列来自于GenBank(AF069131.1)。将获得的基因连接至pET28(a)，获得质粒pET28(a)-BsChi。重组表达质粒pET28(a)-BsChi热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。表达菌在37℃生长至OD600为1.8时，添加0.5mMIPTG。随后，细胞在16℃诱导表达12h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在BufferA(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在BufferE(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在BufferF(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，250mM咪唑，pH7.4)下洗脱并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白BsChi的纯度。结果表明，得到的BsChi酶的产量为4.43mg/L，具有较高纯度，如图1所示。图1是几丁质酶BsChi的SDS-PAGE检测结果图。SmChiA酶的制备SmChiA的序列来自于GenBank(EF451957.1)。将获得的基因连接至pET22(b)，获得质粒pET22(b)-SmChiA。重组表达质粒pET22(b)-SmChiA热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。表达菌在37℃生长至OD600为1.8时，添加0.5mMIPTG。随后，细胞在16℃诱导表达12h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在BufferA(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在BufferE(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在BufferF(2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，其特征在于：编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。
【技术特征摘要】
1.一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，其特征在于：编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：利用所述几丁质酶BsChi水解固态底物α-几丁质和β-几丁质，几丁质酶BsChi的温度为30～50℃，pH值为5～7。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：利用所述几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1组成复合酶，其中，编码所述N-乙酰葡糖胺酶OfHex1基因的核苷酸序列如GenBank(DQ887769.1)所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的复合酶中，几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，刘田，王迪，韩鸿宇，李安节，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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