一种提高肝素抗凝血活性的方法技术

一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3‑O‑硫酸基转移酶（3‑OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素；所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体；本发明专利技术通过对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高肝素抗凝血活性的方法
本专利技术涉及的是一种提高肝素抗凝血活性的方法，属于生化

技术介绍
作为临床上广泛使用的抗凝血药物，肝素从发现至今已经100年了。但是肝素的结构和其在生物体中的功能仍未被完全理解。肝素和相关的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素是一种线性的多糖，由糖醛酸和氨基糖通过1,,4-糖苷键交替相连而成。糖醛酸主要有β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA),还含有少量的α-L-艾杜糖醛酸(IdoUA)，氨基糖则由α-D-氨基葡萄糖胺(GlcN)组成。糖链上还存在着不同的取代基团，糖醛酸残基可以被2-O-硫酸基取代，而氨基葡萄糖的残基可以产生乙酰氨基，N-硫代，3-O-硫代和/或6-O-硫代基团。正是这些取代基团的随机性和多样性造就了肝素复杂的结构和丰富的生物活性。肝素抗凝活性取决于它与丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III(AT)的相互作用。在与肝素结合的过程中，AT发生了一种构象变化，增强了其不可逆转的抑制凝血酶的能力，包括凝血酶和因子Xa。肝素-AT相互识别是研究较为透彻的多糖和蛋白相互作用的实例。肝素和AT的识别和依赖于肝素中特定的肝素五糖结构区域。而这特定的肝素五糖在结构上的主要特征是在五糖中间的氨基葡萄糖残基存在3-O硫酸基修饰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性的提高肝素抗凝血活性的方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的，一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。作为优选：所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体。作为进一步优选：所述的肝素选用1g猪小肠肝素、2MPAPS、0.1g3-OST溶于1LMES缓冲液50mM中，35—40℃反应10—15h，95—100℃水浴加热10—20min，离心取上清，上清浓缩至90—110mL，3500kDa透析袋对蒸馏水透析1.5-2.5天，冷冻干燥后即得反应后产物。本专利技术采用具有较高酶活的3-O-硫酸基转移酶,结合PAPS硫酸基供体,对肝素进行选择性修饰,增加3位硫酸化修饰，提高抗凝血活性中心的数量,从而大幅度提高其抗血栓活性。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术作详细的介绍：本专利技术所述的一种提高肝素抗凝血活性的方法，该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。本专利技术所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体。作为一种优选的实施例，本专利技术所述的肝素选用1g猪小肠肝素、2MPAPS、0.1g3-OST溶于1LMES缓冲液50mM中，35—40℃反应10—15h，95—100℃水浴加热10—20min，离心取上清，上清浓缩至90—110mL，3500kDa透析袋对蒸馏水透析1.5-2.5天，冷冻干燥后即得反应后产物。本专利技术的其它实施例可以在上述公开的基础上，进行数值的简单替换以及同步放大获得无数个具体的实施例，且本领域技术人员在本专利技术公开的基础上，能够方便第实施本专利技术。本专利技术对肝素结构进行改造，人为增加肝素抗凝血活性，提高其效价强度；具体是通过异源表达的3-O-S磺酰基转移酶和磺酰基供体作用于肝素，提高肝素3位硫酸化修饰，进一步提高其生物活性。本专利技术具体的含量和活性检测是：由于3位硫酸化，使肝素裂解酶不能识别3位硫酸化氨基糖相邻的非还原端的酶解位点，而从下一个位点水解，从而得到还原端是3位硫酸化氨基糖，非还原端是不饱和糖醛酸的肝素四糖。不同结构的肝素五糖，会产生不同的3-O-S肝素四糖，所以通过采用肝素裂解酶2对得到肝素进行完全酶解后采用HPLC-MS的方法对3-O-S肝素四糖的分析可以直观的获得肝素3-O-S肝素四糖的结构信息，并进一步得到与肝素活性密切相关的3-O-S肝素五糖的含量。另外对3-O-S肝素5糖的结构和含量的分析还有助于肝素生物活性的构效关系研究。抗凝血活性检测采用标准试剂盒，以肝素为对照，检测对凝血因子的作用。通过对肝素酶解后产物分析产物中3-位硫酸化位点中最普遍的类型由0.48%提高到1.79%，肝素的抗凝血活性至少提高到原来的1.5倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3‑O‑硫酸基转移酶（3‑OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。

【技术特征摘要】
1.一种提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于该方法是以现有肝素为底物,采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)为硫酸基供体,以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶（3-OST）对其进行修饰,得到高抗凝血活性的肝素。2.根据权利要求1所述的提高肝素抗凝血活性的方法，其特征在于所述硫酸基供体的PAPS由微生物发酵产生，或使用极为廉价的PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荫，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33