D-塔格糖的酶促生产制造技术

本公开提供了将糖类酶促转化为塔格糖的方法。本发明专利技术还包括用于制备塔格糖的方法，其中该方法包括采用差向异构酶催化将6‑磷酸果糖(F6P)转化为6‑磷酸塔格糖(T6P)，并采用磷酸酶催化将T6P转化为塔格糖。

Enzymatic production of D- tag sugar

The present disclosure provides a method for converting carbohydrates into sugars. The invention also includes a method for preparing tulose, in which the method includes using differential isomerase to catalyze the conversion of 6 phosphoric acid fructose (F6P) to 6 phosphoric acid talg (T6P), and conversion of T6P into tulose by phosphatase catalysis.

【技术实现步骤摘要】
D-塔格糖的酶促生产本申请要求2015年10月2日提交的美国申请序列号62/236226的优先权，其通过引用并入本文。
本专利技术涉及糖D-塔格糖的制备。更具体地，本专利技术涉及将糖类(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为D-塔格糖来制备D-塔格糖的方法。
技术介绍
D-塔格糖(Tagatose)是一种低热量的天然甜味剂，具有92％的蔗糖甜度，但只有蔗糖38％的卡路里。它是天然存在的单糖己糖，仅少量存在于水果、可可和乳制品中。2003年食品和药品监督管理局(FDA)批准塔格糖为食品添加剂，其指定塔格糖为公认安全使用物质(GRAS)。然而，由于塔格糖售价高，其作为甜味剂的使用受到限制。塔格糖具有无数的健康益处：其是非致龋的；其是低热量的；其具有非常低的血糖指数3；其将葡萄糖的血糖指数降低了20％；其可以降低平均血糖水平；通过提高高密度脂蛋白(HDL)胆固醇，其有助于预防心血管疾病、中风和其他血管疾病；其是经过验证的益生元和抗氧化剂。Lu等人，“Tagatose，aNewAntidiabeticandObesityControlDrug，DiabetesObes.Metab.10(2)：109-34(2008)”。因此，塔格糖明显地在制药、生物技术、学术、食品、饮料、膳食补充剂和杂货业中具有多种应用。目前，主要通过乳糖酶水解乳糖或酸解乳糖形成D-葡萄糖和D-半乳糖来制备塔格糖(WO2011150556、CN103025894、US5002612、US6057135和US8802843)。然后D-半乳糖在碱性条件下由氢氧化钙化学异构化或在pH中性条件下由L-阿拉伯糖异构酶酶促异构化为D-塔格糖。通过过滤和离子交换色谱组合分离最终产物。该过程在几个罐或生物反应器中进行。总之，由于其它糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖和未水解的乳糖)昂贵的分离以及低产率，该方法变差。正在开发几种通过微生物细胞发酵的方法，但是由于它们依赖于昂贵的原料(例如半乳糖醇和D-阿洛酮糖)、产率低和分离昂贵，没有一个被证明是实际的替代方案。需要开发成本有效的合成途径，用于高产率生产塔格糖，其中该方法的至少一个步骤包括能量有利的化学反应。此外，需要一种塔格糖的生产方法，其中其方法步骤可以在一个罐或生物反应器中进行。还需要可以在相对低浓度的磷酸盐条件下进行塔格糖生产的方法，其中磷酸盐可以循环利用，和/或该方法不需要使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐的来源。还需要塔格糖的生产途径，该途径在任何反应步骤中都不需要使用昂贵的烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD(H))辅酶。
技术实现思路
本文所述的专利技术涉及制备塔格糖的方法。在各个方面，该方法包括采用差向异构酶催化将6-磷酸果糖(F6P)转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；和采用磷酸酶催化将T6P转化为塔格糖。本专利技术还涉及通过本文所述的任何方法制备的塔格糖。在本专利技术的一些方面，用于制备塔格糖的方法还包括将6-磷酸葡萄糖(G6P)转化为F6P的步骤，其中该步骤采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化。在其他方面，用于塔格糖合成的方法还包括将1-磷酸葡萄糖(G1P)转化为G6P的步骤，并且该转化步骤采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化。在各个方面，用于制备塔格糖的方法可以包括采用至少一种酶催化将糖类转化为G1P；采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化将G1P转化为G6P；采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。在任何方法中使用的糖类可以选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。淀粉或其衍生物可以是直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖或葡萄糖。在本专利技术的一些方面，用于制备塔格糖的方法包括酶解或酸解淀粉将淀粉转化为淀粉衍生物。在其它方面，淀粉衍生物可以通过酶解淀粉来制备，其由异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或两种或更多种这些酶的组合催化。在某些方面，用于制备塔格糖的方法还可以包括加入4-转葡糖苷酶(4GT)。在各个方面，用于制备塔格糖的方法可以包括采用至少一种酶催化将果糖转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。在其它实施例中，塔格糖的生产方法包括采用至少一种酶催化将蔗糖转化为果糖；采用至少一种酶催化将果糖转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。在本专利技术的其他方面，用于制备塔格糖的方法中使用的G6P可以通过采用至少一种酶催化将葡萄糖转化为G6P来生成。葡萄糖反过来可以通过采用至少一种酶催化将蔗糖转化为葡萄糖来生成。在本专利技术的一些方面，用于将F6P转化为T6P的差向异构酶是6-磷酸果糖差向异构酶。6-磷酸果糖差向异构酶可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQIDNOS：1、3、5、7、9或10具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在各个方面，6-磷酸果糖差向异构酶包含与SEQIDNOS:2、4、6、8或11具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在本专利技术的各个方面，用于将T6P转化为塔格糖的磷酸酶是6-磷酸塔格糖磷酸酶。6-磷酸塔格糖磷酸酶可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQIDNOS:12、14或16具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在本专利技术的一些方面，6-磷酸塔格糖磷酸酶包含与SEQIDNOS:13、15或17具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在各个方面，本专利技术的方法在约40℃至约70℃的温度范围、约5.0至约8.0的pH范围下进行和/或进行约8h至约48h。在一些方面，用于制备塔格糖的方法的步骤在一个生物反应器中进行。在其他方面，这些步骤在串联布置的多个生物反应器中进行。在本专利技术的其他方面，用于制备塔格糖的方法的步骤在无ATP、无NAD(H)、约0mM至约150mM的磷酸盐浓度中进行，循环利用磷酸盐，和/或该方法的至少一个步骤包括能量有利的化学反应。附图说明这些附图说明了本专利技术一些实施例的某些方面，而不应当用于限制或限定本专利技术。图1是将6-磷酸果糖转化为6-磷酸塔格糖，然后转化为D-塔格糖(塔格糖)的酶促途径的示意图；图2是将淀粉或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：αGP，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；IA，异淀粉酶；PA，支链淀粉酶；MP，麦芽糖磷酸化酶；PPGK，多磷酸盐葡糖激酶；图3示出了将纤维素或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径。CDP，纤维糊精磷酸化酶；CBP，纤维二糖磷酸化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备塔格糖的方法，所述方法包括：采用差向异构酶催化，将6‑磷酸果糖(F6P)转化为6‑磷酸塔格糖(T6P)；和采用磷酸酶催化，将生成的T6P转化为塔格糖；其中，a)所述差向异构酶是6‑磷酸果糖差向异构酶；b)所述磷酸酶是6‑磷酸塔格糖磷酸酶，或c)所述差向异构酶是6‑磷酸果糖差向异构酶且所述磷酸酶是6‑磷酸塔格糖磷酸酶。

【技术特征摘要】
2015.10.02 US 62/236,2261.一种制备塔格糖的方法，所述方法包括：采用差向异构酶催化，将6-磷酸果糖(F6P)转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；和采用磷酸酶催化，将生成的T6P转化为塔格糖；其中，a)所述差向异构酶是6-磷酸果糖差向异构酶；b)所述磷酸酶是6-磷酸塔格糖磷酸酶，或c)所述差向异构酶是6-磷酸果糖差向异构酶且所述磷酸酶是6-磷酸塔格糖磷酸酶。2.根据权利要求1所述的方法，还包括将6-磷酸葡萄糖(G6P)转化为F6P的步骤，其中该步骤采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化。3.根据权利要求2所述的方法，还包括将1-磷酸葡萄糖(G1P)转化为G6P的步骤，其中该步骤采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化。4.根据权利要求3所述的方法，还包括将糖类转化为G1P的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化，其中所述糖类选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。5.根据权利要求4所述的方法，其中至少一种酶选自由α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和纤维素磷酸化酶组成的组。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述糖类是淀粉或其衍生物，所述淀粉或其衍生物选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖和葡萄糖组成的组。7.根据权利要求4或6所述的方法，还包括将淀粉转化为淀粉衍生物的步骤，其中所述淀粉衍生物通过淀粉的酶解或通过淀粉的酸解来制备。8.根据权利要求6所述的方法，其中在该方法步骤中加入4-转葡糖苷酶(4GT)。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述淀粉衍生物通过异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或它们的组合催化淀粉酶解来制备。10.根据权利要求1所述的方法，还包括：将果糖转化为F6P的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化；和任选地，将蔗糖转化为果糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化。11.根据权利要求2所述的方法，还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·维歇莱茨基，Y·H·P·张，
申请(专利权)人：博努莫斯生化有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US