包含使用乙酰微小杆菌和凝结芽孢杆菌α-葡聚糖转移酶的组合物和方法技术

提供了从乙酰微小杆菌分离的和/或纯化的α‑葡聚糖转移酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码所述α‑葡聚糖转移酶的合成核酸及其变体；包含所述合成核酸的宿主细胞；以及包含所述α‑葡聚糖转移酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造低聚糖。

Compositions and methods comprising acetobacillus acetus and Bacillus coagulase alpha glucan transferase

It provides a and / or purified alpha glucan transferase isolated and / or purified from acetyl trinibacilli, its recombinant engineered variant, and its active fragment, encoding the synthetic nucleic acid and its variants of the alpha glucan transferase, including the host cells of the nucleic acid synthesis, and the composition containing the alpha glucan transferase. The methods of using these compositions include the manufacture of oligosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含使用乙酰微小杆菌和凝结芽孢杆菌α-葡聚糖转移酶的组合物和方法相关申请的交叉引用：本申请要求美国临时申请序列号62/238,054的权益，通过引用将其结合在此。
：提供了从乙酰微小杆菌(ExiguobacteriumAcetylicum)分离的和/或纯化的α-葡聚糖转移酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码所述α-葡聚糖转移酶的合成核酸及其变体；包含所述合成核酸的宿主细胞；以及包含所述α-葡聚糖转移酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造低聚糖。序列表：附加了包含SEQIDNO:1-13的序列表，并且将该序列表以其全文通过引用结合在此。
技术介绍
：由于其有益的健康效应，异麦芽低聚糖(IMO)型的葡萄糖低聚糖(GOS)受到越来越多的关注[VitaFiberTM-IMO](1)。IMO是由具有α-(1→6)糖苷键的葡萄糖单元组成的葡萄糖低聚糖(但取决于IMO制造方式)，除了α-1,6连接的葡萄糖单元外，它们可能还含有另外的糖苷键，如α-1,3和α-1,4。异麦芽低聚糖可以通过不同的酶进行酶促产生。商业IMO主要使用来源于淀粉水解的麦芽糖糊精作为原料(2)从真菌糖基转移酶获得。另一种获得IMO的方法是用葡聚糖酶(3)水解葡聚糖。葡聚糖蔗糖酶(GTF)是细胞外酶，历史上它们因其从蔗糖合成多种α-葡聚糖多糖(如葡聚糖、变聚糖、交替糖(alternan)和罗伊氏糖(reuteran))的能力而为人所知(4)(5)，并且在适当的受体存在下，可以合成各种低聚糖，如潘糖低聚糖系列和异麦芽低聚糖系列(6)(7)(8)。与GH13的淀粉酶一起，GH70的葡聚糖蔗糖酶属于GH-H族，其含有(β/α)8筒结构。然而，GH70酶具有环形排列的(β/α)8催化结构域(9)。此外，在α-淀粉酶家族GH13成员中鉴定的四个保守区域(区域I至IV)存在于GH70酶中，但作为该环形排列的结果，区域I在GH70酶中的区域II至IV的C-末端出现。GH70成员可以分为三个不同的亚家族，如针对大的GH13家族所做的那样(10)，其中所有三个亚家族仅在乳酸菌中发现(图1A)：1)使用蔗糖为底物合成α-葡聚糖聚合物的常见的GH70GTF，(4)(5)2)使用蔗糖作为供体和葡聚糖作为受体在葡聚糖骨架中引入α-1,2和α-1,3分支而分支的GH70GTF(CBM11pers.comm.M.Remaud-Simeon)，(11)(12)3)使用MOS和淀粉作为底物引入α-(1→6)糖苷键的4,6-α-Gt，(13)(14)(15)GH70亚家族1是使用蔗糖合成各种α-葡聚糖聚合物的常见GH70酶。根据具有各种键类型的葡聚糖酶，合成支链和分子量(4)(5)。GH70亚家族2具有通过引入α-1,2和α-1,3分支来修饰葡聚糖骨架的能力(11)(12)。GH70亚家族3(4,6-α-GT酶)由MOS合成，该MOS为线性IMO-MALT，其由与α-(1→4)连接的葡萄糖单元的α-糖基偶联的α-(1→6)连接的葡萄糖部分组成(15)(16)(17)[还参见涉及多糖和低聚糖及其营养效应的PCT公开号WO2010/128859]。
技术实现思路
：乙酰微小杆菌带有有效合成广泛葡萄糖低聚糖的α-葡聚糖转移酶(α-GT-E)，所述葡萄糖低聚糖含有来自MOS、麦芽糖糊精和淀粉的α-1,4和α-1,6糖苷键。提供了分离的和/或纯化的α-葡聚糖转移酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码所述α-葡聚糖转移酶的合成核酸、其变体、或其活性片段；包含所述合成核酸的宿主细胞；以及包含所述α-葡聚糖转移酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造葡萄糖低聚糖。词汇表：BLAST基本局部比对搜索工具CAZy碳水化合物活性酶数据库EDTA乙二胺四乙酸MOS麦芽低聚糖IMO异麦芽低聚糖GH70糖苷水解酶的家族70GPC凝胶渗透色谱HOD信号来自水的NMR信号，在该水中一个质子被替换为氘HPAEC高效阴离子交换色谱HPLC高效液相色谱HPSEC高效尺寸排阻色谱HSQC异核单量子相干α-GT-E来自乙酰微小杆菌的推定的α-葡聚糖转移酶MALLS多角度激光散射NMR核磁共振RI折射率SEC尺寸排阻色谱TLC薄层色谱通用缓冲液乙酸、硼酸和磷酸的混合物附图说明：图1.A)显示不同GH70亚家族的示意图(1)使用蔗糖作为底物合成α-葡聚糖聚合物的常见GH70GTF，2)使用蔗糖作为供体和葡聚糖为受体在葡聚糖骨架中引入α-1,2和α-1,3分支而分支的GH70BRS，3)使用MOS和淀粉作为底物引入α-(1→6)糖苷键的4,6-α-GT。B)新的GH70亚家族4)α-GT，使用MOS和麦芽糖糊精作为底物的没有环形排列(β/α)8筒结构并因此没有保守区域的GH13顺序的唯一GH70成员。图2.pHYT-α-GT-E的质粒图图3A.(推定的)GH70亚家族4α-GT蛋白质(不具有环形排列的(β/α)8筒)的无根系统树。用MEGA4使用邻接法完成比对和系统树图构建。(以百分比计的)步长值(bootstrapvalue)显示在分支点处。比例尺对应于0.1个取代的遗传距离/位置(10％氨基酸序列差异)。黑色：来自公共数据库的推定α-GT；灰色：来自杜邦数据库的推定α-GT。图3B.来自亚家族1、2、3和4的GH70的催化结构域中保守区(I、II、III、IV)的氨基酸序列比对。GH70_1：葡聚糖蔗糖酶(GTFA、GTFO、GTF180和GTFML1)，GH70_2：分支蔗糖酶(DSRECD2和BRSA)，GH70_3：4,6-α-葡聚糖转移酶(4,6-α-GT-B、4,6-α-GT-W和4,6-α-GT-ML4)以及GH70_4：α-葡聚糖转移酶(乙酰微小杆菌DSM20416的α-GT-E、凝结芽孢杆菌(B.coagluans)2-6的α-GT-S和凝结芽孢杆菌2022696的α-GT-L)。七个严格保守的氨基酸残基，对不同GH70亚家族中的-1和+1亚位点具有重要贡献，显示为浅灰色。三个催化残基以粗体显示。ND：未确定。图4.pH对α-GT-E活性的影响(A)。在1mMCaCl2存在下在37℃下，通过在含有1mMCaCl2的186mM通用缓冲液中利用0.0375g/lα-GTE酶测量由PABAH在30分钟内从1％zulkowsky淀粉释放的还原糖的量而确定酶活性。在补充有1mMCaCl2的186mM通用缓冲液(pH5.0)中确定温度(B)的影响(平均值±S.E.M.；n＝3)。图5.α-GT-E的SDS-PAGE显示阴离子纯化后的上清液(原始的)和级分(5-13)。图6.在含有1mMCaCl2的10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中用20mM麦芽低聚糖孵育5小时的0.0375g/lα-GT-E的反应产物的TLC分析。G2，麦芽糖；G3，麦芽三糖；G4，麦芽四糖；G5，麦芽五糖；G6，麦芽六糖；G7，麦芽七糖以及pan，潘糖。图7.(A)麦芽糖糊精DE13-17和(B)在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)中用10％α-GT-E上清液孵育24小时的麦芽糖糊精DE13-17的500-MHz一维1HNMR分析。图8.在含有1mMCaCl2的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0，45℃)中用20mM麦芽四糖(G4)、麦芽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的重组表达的GH70亚家族4,α‑葡聚糖转移酶、其重组工程化变体或其活性片段，其中所述α‑葡聚糖转移酶能够通过歧化麦芽低聚糖(MOS)样底物并引入α‑(1→6)糖苷键来合成葡萄糖低聚糖的混合物，并进一步合成IMO，即具有α‑(1→6)糖苷键的葡萄糖低聚糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.06 US 62/238,0541.一种分离的重组表达的GH70亚家族4,α-葡聚糖转移酶、其重组工程化变体或其活性片段，其中所述α-葡聚糖转移酶能够通过歧化麦芽低聚糖(MOS)样底物并引入α-(1→6)糖苷键来合成葡萄糖低聚糖的混合物，并进一步合成IMO，即具有α-(1→6)糖苷键的葡萄糖低聚糖。2.一种来自乙酰微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)(α-GT-E)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)2-6(α-GT-S)或凝结芽孢杆菌2022696[杜邦培养物保藏中心](α-GT-L)的分离的重组表达的α葡聚糖转移酶。3.如权利要求2所述的α-葡聚糖转移酶[(α-GT-E、α-GT-S、α-GT-E)]，其包含由SEQIDNO:2的氨基酸AA31-731[FAPS….KAPV]、SEQIDNO:7的氨基酸AA33-736[YTSG….AATP]、SEQIDNO:11的氨基酸AA22-726[YTSG….AATP]组成的多肽、其重组工程化变体或其活性片段，其中所述变体能够歧化麦芽低聚糖(MOS)并引入α-(1→6)糖苷键，并且其中所述变体与SEQIDNO:2的氨基酸AA31-731[FAPS….KAPV]、SEQIDNO:7的氨基酸AA33-736[YTSG….AATP]、SEQIDNO:11的的氨基酸AA22-726[YTSG….AATP]具有至少60％的序列同一性。4.如权利要求2所述的α-葡聚糖转移酶，其中所述α-GT-E、(α-GT-S)、(α-GT-L)能够进一步产生线性葡萄糖低聚糖。5.如权利要求1所述的α-葡聚糖转移酶，其中包含由SEQIDNO:2的氨基酸31-736、SEQIDNO:7的氨基酸33-736和SEQIDNO:11的氨基酸22-726组成的多肽的多肽包含通常不与天然存在的来自乙酰微小杆菌DSM20416(SEQIDNO:2)的α-GT-E、来自凝结芽孢杆菌2-6的α-GT-S、来自凝结芽孢杆菌2022696的α-GT-L有关的至少一个氨基酸。6.如权利要求1所述的α-葡聚糖转移酶，其中所述重组工程化变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列的氨基酸31-731、SEQIDNO:7的氨基酸33-736和SEQIDNO:11的氨基酸22-726具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。7.如权利要求5所述的α-葡聚糖转移酶，其中所述重组工程化变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列的氨基酸31-731、SEQIDNO:7的氨基酸33-736和SEQIDNO:11的氨基酸22-726具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。8.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·克拉利，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK