一种具有磷脂酶B活性的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有磷脂酶B活性的突变体及其应用。利用定点突变得到了改进的具有磷脂酶B活性的突变体，可有效用于制备甘油磷酸胆碱。本发明专利技术亦涉及包含编码所述突变体酶的多核苷酸和该多核苷酸的核苷酸构建体、载体和宿主细胞，连同生产所述突变体以及使用该突变体的方法。

A mutant with phospholipase B activity and its application

The invention relates to a mutant with phospholipase B activity and its application. The mutant with phospholipase B activity has been improved by site directed mutagenesis, and it can be effectively used to prepare glyceryl phosphorylcholine. The invention also relates to the nucleotides, vectors and host cells containing the polynucleotide and the polynucleotide encoding the mutant enzyme, together with the production of the mutant and the method for the use of the mutant.

【技术实现步骤摘要】
一种具有磷脂酶B活性的突变体及其应用序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
本专利技术属于生物
，涉及一种具有磷脂酶B的突变体及其应用，具体而言，是涉及一种具有磷脂酶B活性的突变体及其应用于甘油磷酸胆碱的制备。
技术介绍
磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶A1、A2、B、C、D等。其中磷脂酶A1、磷脂酶A2可以特异水解磷脂甘油Sn-1或Sn-2位上的酰基，生成溶血磷脂和游离脂肪酸，从而去除非水化磷脂。磷脂酶B（PLB）具有水解酶和溶血磷脂酶-转酰基酶的活性，水解酶的活性能同时水解Sn-1和Sn-2位酰基，清除磷脂和溶血磷脂中的脂肪酸，转酰基酶活性则将游离脂肪酸转移到溶血磷脂而生成磷脂。磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物（特别是小麦淀粉的水解产物）的后续处理以提高过滤通透能力。甘油磷酸胆碱(L-alphaglycerylphosphorylcholine，L-α-GPC)由胆碱、甘油和磷酸盐组成，是合成乙酰胆碱神经递质的前体，和所有体细胞中重要的营养素。甘油磷酸胆碱的临床研究已经显其在改善神经学脑功能和认知表现方面具有重要的医药应用价值，可用于治疗如阿尔茨海默氏症、小脑性共济失调、精神分裂症和双相情感障碍等，但是就作为药用原料及相关研究而言需要较高纯度的L-α-GPC。然而遗憾的是天然L-α-GPC的含量较少，故制备纯度高、质量好的甘油磷酸胆碱产品具有重要意义。酶法制备甘油磷酸胆碱是指在一定条件下，利用PLB能够水解磷脂Sn-l和Sn-2位脂肪酸酰基的作用催化磷脂酰胆碱反应生成甘油磷酸胆碱，该方法相比化学合成具有反应条件温和、产品得率高、质量好等优点。故需要开发或改造出具有更高活性的PLB来提高甘油磷酸胆碱生产效率，从而提高生产经济效益。
技术实现思路
本专利技术提供一种具有磷脂酶B活性的突变及其应用，利用定点突变技术对具有磷脂酶B活性的蛋白进行改造，提高其在制备甘油磷酸胆碱中的效率。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种具有磷脂酶B活性的突变体，含有选自如下所示的氨基酸序列之一：(a)、SEQIDNo：1至SEQIDNo：4所示的序列；(b)、与(a)中所示序列具有至少90%同一性且具有改进的磷脂酶B活性的序列；或(c)、(a)中的序列经缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸残基而得到具有改进的磷脂酶B活性的序列；其中(b)中所示的序列不是SEQIDNo：5所示的序列。在一个实施方案中，所述的具有磷脂酶B活性的突变体含有如SEQIDNo：4所示的氨基酸序列。也可以含有SEQIDNo：1、2、3所示的氨基酸序列。本专利技术还涉及如上所述的磷脂酶B突变体的核苷酸编码序列，其含有如下所示的序列：(a)、SEQIDNo：7-10所示的序列；(b)、与(a)中所述的序列具有至少90%同一性且编码具有改进的磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的序列；或(c)、与(a)中所述的序列在高严格条件下杂交且编码具有改进的磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的序列。在一个实施方案中，所述核苷酸编码序列含有如SEQIDNo：9所示的序列。本专利技术亦涉及包含一种核酸构建体或表达载体，其包含上述方案中所述的多肽或蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。本专利技术亦涉及包含一种重组宿主细胞，其包含上述方案中的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。本专利技术提供了一种产生具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的方法，所述方法包括：(a)、在有助于所述多肽或蛋白质的产生的条件下培养权利要求6的宿主细胞；和(b)、回收所述多肽或蛋白质。本专利技术亦涉及一种组合物，其包含上述方案中的多肽或蛋白质和其它酶。本专利技术提供了一种制备及检测甘油磷酸胆碱的方法，该方法包括：（a）、将含有磷脂酰胆碱、pH4.5-9.0的缓冲液、EDTA、TritonX-100以及磷脂酶B（具有磷脂酶B活性的野生型蛋白或突变体蛋白）的相同标准反应体系，在37℃下分别反应4-30h后，100℃水浴5min终止酶反应；（b）、从（a）中各反应体系取等量反应液分别加入到含有甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶（GPCP）、Tris-HCl缓冲液及CaCl2的相同反应体系中，37℃下反应20min；（c）、从（b）中各反应体系取等量反应液分别加入到含有碱性磷酸酶（AP）、glycine-NaOH缓冲液、MgCl2及ZnCl2的相同反应体系中，56℃下反应10min；（d）、用BIOMOLGreenReagent磷酸盐显色试剂盒检测（c）中各反应体系产生的无机磷酸盐含量，而上述磷脂酶B催化产生的甘油磷酸胆碱的含量即等于各体系中的无机磷酸盐的含量。上述方案中，所述有关内容解释如下：本专利技术以来源于Streptomycessp.Sge12菌的具有磷脂酶B活性的假定的蛋白的基因（如SEQIDNo：6所示）为出发基因，进行基因突变，通过定向筛选获得了活性提高的突变体酶。本专利技术的来源于Streptomycessp.Sge12菌的具有磷脂酶B活性的突变体的氨基酸序列含有如下序列：(1)SEQIDNo：1所示的氨基酸序列：突变位点为H49K：MRCASATQRSMHIRGQVHPLPGIDQRVNLACSGAETVNVLSTAAGGQPKLGEAPQTDRLAAVARTARVRLIALSIGGNDLGFGAIIGDCAYDWYFRRLCWKKQAPVVEQKLPGVRAKVTAVVDDIRATMRAAGYADGDYRLVLQSYPSPIPGGESFRLNQNDSDRMFKDGCPFNDRDADWAAYTLVPRIGDMVEAVAGARGTDYLDLRDALAGHEVCALGPEQVGQTGPDARRHEWFRFLDRVNTQGTLEESMHPNAHGQRAMAVCLGLVGAAAPGRYACTQDWFGDGDPSRMRIRQAV(2)SEQIDNo：2所示的氨基酸序列：突变位点为G190S：MRCASATQRSMHIRGQVHPLPGIDQRVNLACSGAETVNVLSTAAGGQPHLGEAPQTDRLAAVARTARVRLIALSIGGNDLGFGAIIGDCAYDWYFRRLCWKKQAPVVEQKLPGVRAKVTAVVDDIRATMRAAGYADGDYRLVLQSYPSPIPGGESFRLNQNDSDRMFKDGCPFNDRDADWAAYTLVPRISDMVEAVAGARGTDYLDLRDALAGHEVCALGPEQVGQTGPDARRHEWFRFLDRVNTQGTLEESMHPNAHGQRAMAVCLGLVGAAAPGRYACTQDWFGDGDPSRMRIRQAV(3)SEQIDNo：3所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有磷脂酶B活性的突变体，其特征在于：含有选自如下所示的氨基酸序列之一：(a)、SEQ ID No：1至SEQ ID No：4所示的序列；(b)、与(a)中所示序列具有至少90%同一性且具有改进的磷脂酶B活性的序列；或(c)、(a)中的序列经缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸残基而得到具有改进的磷脂酶B活性的序列；其中(b)中所示的序列不是SEQ ID No：5所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种具有磷脂酶B活性的突变体，其特征在于：含有选自如下所示的氨基酸序列之一：(a)、SEQIDNo：1至SEQIDNo：4所示的序列；(b)、与(a)中所示序列具有至少90%同一性且具有改进的磷脂酶B活性的序列；或(c)、(a)中的序列经缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸残基而得到具有改进的磷脂酶B活性的序列；其中(b)中所示的序列不是SEQIDNo：5所示的序列。2.根据权利要求1所述的磷脂酶B活性的突变体，其特征在于：含有如SEQIDNo：1、2、3或4所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的磷脂酶B活性的突变体，其特征在于：含有如SEQIDNo：4所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的磷脂酶B活性的突变体，其特征在于：所述的磷脂酶B突变体的核苷酸编码序列，其含有如下所示的序列：(a)、SEQIDNo：7-10所示的序列；(b)、与(a)中所述的序列具有至少90%同一性且编码具有改进的磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的序列；或(c)、与(a)中所述的序列在高严格条件下杂交且编码具有改...

【专利技术属性】
技术研发人员：严明，陈圣，章志林，魏淼，陈晶晶，
申请(专利权)人：江苏中酶生物科技有限公司，南京新之酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32