2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林J的曲霉菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，涉及一种2‑甲基丁酸侧链水解酶和能够合成该水解酶从而生产莫纳可林J的菌株。本发明专利技术提供的2‑甲基丁酸侧链水解酶能够有效水解洛伐他汀为莫纳可林J，酶活性高，从而简化了辛伐他汀的生产工艺，降低成本，提高生产效率，减少环境污染。

2- methyl butyric acid side chain hydrolase and monascin J producing Aspergillus strain and its construction method and Application

The invention belongs to the field of biopharmaceutical technology, and relates to a 2 - methyl butyric acid side chain hydrolase and a strain capable of synthesizing the hydrolase so as to produce monalcone J. The 2 methyl butyric acid side chain hydrolase provided by the invention can effectively hydrolyze lovastatin to monalin J with high enzyme activity, thus simplifying the production process of simvastatin, reducing the cost, improving production efficiency and reducing environmental pollution.

【技术实现步骤摘要】
2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林J的曲霉菌株及其构建方法与应用
本专利技术属于生物制药
，涉及一种2-甲基丁酸侧链水解酶及其应用；更进一步地，涉及莫纳可林J的生产。
技术介绍
心脑血管疾病严重威胁人类健康，其发病率和死亡率在许多国家和地区排名第一。高脂血症(高胆固醇血症)是心脑血管疾病的一个重要诱因，因此预防高脂血症、调节血脂和降低血脂成为防治心脑血管疾病的关键。基于上述原因，降胆固醇药物具有很大的市场前景，多年来一直位于全球畅销药物的前列。辛伐他汀(Simvastatin)即舒降之(Zocor)，是Merck公司研发的一种重要的降血脂药物，能有效地抑制胆固醇的体内合成，是治疗高脂血症的首选药物之一。随着2006年专利到期，辛伐他汀的市场竞争日益激烈，其工艺技术研究和生产成本成为产品竞争的重要因素。辛伐他汀并非天然化合物，而是以土曲霉的发酵产物洛伐他汀(lovastatin)为原料通过化学合成的。辛伐他汀和洛伐他汀的区别仅在于侧链多一个甲基，辛伐他汀为2,2-二甲基丁酸侧链，洛伐他汀为2-甲基丁酸侧链。在辛伐他汀的合成过程中，需要先去除洛伐他汀C8位的2-甲基丁酸侧链，获得莫纳可林J(MonacolinJ)，然后再通过后续工艺将2,2-二甲基丁酸侧链添加到莫纳可林J的C8位上，从而获得辛伐他汀。由此可见，莫纳可林J是辛伐他汀合成的重要前体物。目前，辛伐他汀的合成路线中，采用化学方法水解洛伐他汀制备莫纳可林J，整个制备过程中会使用到大量的酸、碱，以及二氯甲烷、甲苯和乙醚等有机试剂，工艺复杂、耗时长、收率低、污染压力大。基因工程改造是一种有效的遗传育种技术。如果能够通过基因工程改造方法对产洛伐他汀土曲霉进行遗传改造，使之能够直接发酵生产莫纳可林J，那么就可以简化辛伐他汀的合成工艺，降低生产成本，同时还可以减少环境污染，从而提高产品的市场竞争力。因此，如果能找到一种简单高效、环境友好的莫纳可林J生产方法，不仅会简化辛伐他汀的合成工艺，降低生产成本，还可以减少环境污染，从而提高产品的市场竞争力。同时，酶法是一种绿色高效的生物催化方法，自然界中也存在一些微生物能水解掉洛伐他汀的侧链，因此也可以基于这类酶开发出莫纳可林J的酶法生产工艺。在制备辛伐他汀的专利申请(WO2005040107A2)中公布了一种能水解洛伐他汀侧链的β-内酯酶及用其制备莫纳可林J的方法。但是，这种水解酶的活性偏低。此外，由于洛伐他汀和辛伐他汀的结构相似，在工艺上很难分离，使得洛伐他汀残留成为辛伐他汀生产的一个棘手问题。
技术实现思路
本专利技术通过提供一种能够产莫纳可林J的曲霉菌株而解决现有技术中存在的技术问题。在一个方面，本专利技术提供一种生物材料，为(1)一种蛋白质，为2-甲基丁酸侧链水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；(2)一种核酸分子，其编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质；优选地，所述核酸分子的序列如SEQIDNO:2所示；或(3)包含(2)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。在第二个方面，本专利技术提供氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质在水解含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质中的应用；优选地，所述含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质为洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀；进一步优选地，所述洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀为酸式、内酯式或盐式。在第三个方面，本专利技术提供一株产莫纳可林J的曲霉菌株，其能够生产氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质。优选地，所述曲霉菌株包含能表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质的表达盒；进一步优选地，所述曲霉菌株包含核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的核酸分子。在第四个方面，本专利技术提供一种构建所述产莫纳可林J的曲霉菌株的方法，包括将出发曲霉菌株原生质体与包含核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的核酸分子的DNA片段共培养，经筛选后得到。优选地，所述出发曲霉菌株为曲霉菌(Aspergillussp.)HZ01，其保藏编号为CGMCCNO.12970。本专利技术中使用的出发曲霉菌(Aspergillussp.)HZ01于2016年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.12970，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。曲霉菌株原生质体的制备、原生质体与DNA片段的共培养、阳性曲霉菌的筛选等都是本领域的常规技术。在第五个方面，本专利技术提供上述的核酸分子或包含所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物在制备产莫纳可林J的曲霉菌株中的应用。在第六个方面，本专利技术提供一种制备莫纳可林J的方法，包括发酵培养本专利技术提供的曲霉菌株，或者用氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的本专利技术的蛋白质水解洛伐他汀。在第七个方面，本专利技术提供上述的生物材料或曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在制备莫纳可林J中的应用。在第八个方面，本专利技术提供上述的生物材料或曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在生产降血脂药物中的应用，其中所述降血脂药物是辛伐他汀。本专利技术提供的产莫纳可林J的曲霉菌株能够产生2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST，在菌体内有效水解洛伐他汀为莫纳可林J，酶活性高，水解效率高，从而简化了辛伐他汀的生产工艺，降低成本，提高生产效率，减少环境污染。附图说明图1为SDS-PAGE分析纯化后的2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST和EcBla4蛋白；其中，M：蛋白质标记；1：纯化后的PcEST蛋白；2：纯化后的EcBla4蛋白。图2为各种他汀类物质及不同存在形式；其中，A：洛伐他汀、莫纳可林J及辛伐他汀的结构及转化关系；B：美伐他汀及其衍生物普伐他汀的结构及转化关系；C：洛伐他汀的三种不同存在形式。图3为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解三种形式洛伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式洛伐他汀；B：内酯式洛伐他汀；C：洛伐他汀钠盐。图4为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式美伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式美伐他汀；B：内酯式美伐他汀。图5为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式普伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式普伐他汀；B：普伐他汀钠盐。图6为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式辛伐他汀的HPLC分析结果；A：酸式辛伐他汀；B：内酯式辛伐他汀。图7为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解莫纳可林J的HPLC分析结果。图8为两种2-甲基丁酸侧链水解酶水解酸式洛伐他汀的HPLC分析结果。图9为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解辛伐他汀样品中的洛伐他汀的HPLC分析结果。图10为pG3H的质粒图谱示意图。图11为过表达PcEST的曲霉转化子的基因组PCR验证结果；其中，2#、3#、4#、5#为共转化方法构建的转化子，52#、54#、58#、60#、b1#为筛选标记串联方法构建的转化子，wt为对照菌株HZ01菌株。图12为工程菌株细胞提取液中的PcEST活性分析结果；其中，A：对照菌株HZ01菌株；B：4#工程菌株；C：5#工程菌株；D：52#工程菌株；E：58#工程菌株。图13为工程菌株发酵第四天样品中洛伐他汀和莫纳可林J含量的HPLC分析结果；其中A：4株对照菌株HZ01菌株的分析结果；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物材料，为(1)一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；(2)一种核酸分子，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示；或(3)包含(2)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。

【技术特征摘要】
1.一种生物材料，为(1)一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；(2)一种核酸分子，其编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质；优选地，所述核酸分子的序列如SEQIDNO:2所示；或(3)包含(2)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。2.氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质在水解含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质为洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀。4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀为酸式、内酯式或盐式。5.一株产莫纳可林J的曲霉菌株，其能够生产氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质；优选地，所述曲霉菌株包含能表达氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质的表达盒；进一步优选地，所述曲霉菌株包含核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，黄雪年，杨勇，郑玲辉，黄隽，滕云，应玲萍，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37