一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于土壤的新型阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该酯酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(FAE‑Xuan)分子量大小为29kDa。FAE‑Xuan对底物阿魏酸甲酯的催化活性最高，酶活为40U/mg，其最适温度为30℃，最适pH为5.0。在pH 3.0‑10.0下反应4h后，该酶仍能保持75％以上的活性，显示出较强的pH稳定性。本新型阿魏酸酯酶FAE‑Xuan对金属离子和有机溶剂的耐受性较好。底物利用偏好性及系统发育分析表明FAE‑Xuan属于A型阿魏酸酯酶。本发明专利技术中FAE‑Xuan的这些良好酶学性质，使其在食品、制药和饲料等领域的工业生产中具有广泛的应用前景。

A new ferulic acid esterase and its coding genes and Application

The present invention provides a novel ferulic acid enzyme gene derived from soil, and its nucleotide sequence and amino acid sequence are shown by SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2, respectively. The esterase gene was heterologous expression in Escherichia coli BL21 (DE3), and the purified recombinant FAE (Xuan) was 29kDa. FAE Xuan has the highest catalytic activity for substrate ferulic acid methyl ester, the enzyme activity is 40U/mg, the optimum temperature is 30 degrees, and the optimum pH is 5. After 4H reaction at pH 3, 10, the enzyme still maintained over 75% activity and showed strong pH stability. The new ferulic acid esterase FAE Xuan has good tolerance to metal ions and organic solvents. Substrate preference and phylogenetic analysis showed that FAE Xuan belongs to A ferulic acid esterase. These good enzymatic properties of FAE Xuan in the invention make it have a wide application prospect in the industrial production of food, pharmaceutical and feed fields.

【技术实现步骤摘要】
一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种利用宏基因组文库功能筛选的方法从土壤样品中获得一种新型阿魏酸酯酶，其编码基因及其应用。
技术介绍
阿魏酸酯酶(Feruloylesterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，在植物细胞壁降解过程中起关键作用，能使阿魏酸和与之结合的单糖或低聚糖释放出来。释放出的阿魏酸具有许多良好的生理功能，如：抗癌、抗血栓、抗动脉粥样硬化和清除自由基等。此外，FAE在食品、制药、造纸和饲料工业也有广泛的应用前景。FAE来源广泛，普遍存在于植物、真菌和细菌中，植物中的FAE一般含量较低，研究较少，而真菌和细菌中FAE较为丰富，研究比较深入。研究FAE的方法一般有直接发酵提取法和异源表达法，前者是以羟基肉桂酸酯类化合物(如阿魏酸酯、阿魏酸糖苷、对羟基-香豆酸酯、咖啡酸酯、介子酸酯等)为底物筛选产FAE的活性菌株，并从该菌株的发酵产物中得到FAE，然而，大多数野生菌株产FAE能力很低，如黑曲霉发酵后酶活仅在0.01-0.096U/mL之间，大大限制了该酶在工业中的应用；后者是通过基因工程方法，分子克隆FAE的基因并在合适的宿主中表达，然后分离纯化得到酶，与直接发酵提取法相比，异源表达法能显著提高酶的产量和酶的活性，目前已经有多种FAE在异源宿主(如大肠杆菌、丝状真菌、毕赤酵母等)中成功实现表达。然而研究表明，在现有实验条件下仅有极少数的微生物可被培养，超过99％的微生物都是不可培养的，极大限制了新型阿魏酸酯酶的开发与利用。随着分子生物学和生物信息学的发展，宏基因组学技术逐渐成为研究不可培养微生物的有效手段。宏基因组学技术是不依赖培养为基础的微生物研究方法，该方法避开了传统微生物的分离培养问题，直接提取环境中的总DNA转化克隆到可培养的宿主中，形成重组DNA文库，使文库中既包含了可培养微生物的基因又包含了不可培养微生物的基因，文库基因经过筛选后，异源表达获得目标产物。宏基因组学在新型FAE筛选和发现方面有多项成功报道，这些新酶大多来源于不可培养的未知微生物，与已知酶基因相比，序列相似性较低，活性更高。如Cheng等人采用宏基因组学方法，从荷斯坦奶牛瘤胃菌群中筛选到一种新的FAEFAE-SH1，编码酶蛋白与已知FAE相比，仅有56％的相似性，对4种羟基肉桂酸甲酯具有水解作用，说明该酶对底物具有宽广的特异性，酶经纯化后活性高达259.5U/mg，是现有最高FAE酶活性(来源于嗜酸乳杆菌L.acidophilusIFO13951)的251倍，该酶与木聚糖内切酶、葡聚糖酶、果胶酶一起使用，能够显著提高麦草中阿魏酸的释放量。这些优良的性质说明FAE-SH1在生物质降解、饲料生产和促进人体健康方面有巨大的潜力，充分说明宏基因组学是挖掘和发现新型FAE的一种有力工具。
技术实现思路
本专利技术从土壤宏基因组文库中筛选到一种新型阿魏酸酯酶基因，并对该基因进行了异源表达，重组酶具有较高的酶活、酸性、pH稳定性、对大多数金属离子和有机溶剂有耐受性等特点，可广泛应用于食品、制药与饲料等工业领域。本专利技术的第一个目的在于提供一种新型阿魏酸酯酶。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述新型阿魏酸酯酶的基因。本专利技术的第三个目的在于提供上述基因的宏基因组学筛选方法。本专利技术的第四个目的在于提供含有上述新型阿魏酸酯酶基因的表达载体。本专利技术的第五个目的在于提供一种重组阿魏酸酯酶的制备方法。本专利技术的第六个目的在于提供用于新型阿魏酸酯酶的基因的特异性扩增引物。本专利技术的第七个目的在于提供上述新型阿魏酸酯酶在食品、制药和饲料工业中的应用。本专利技术采取的技术方案如下：一种新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。上述编码新型阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法，包括以下步骤：提取土壤总DNA,构建cosmid宏基因组文库，利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码阿魏酸酯酶的基因。进一步的，其具体步骤为，提取土壤总DNA,并纯化,构建cosmid宏基因组文库；利用底物筛选平板筛选阳性克隆子，HPLC验证其阿魏酸酯酶活性；提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coliDH5α；使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆，经测序和BlastP比较，从而筛选获得编码阿魏酸酯酶的基因。更进一步的，所述编码阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法：提取土壤样品DNA,采用cosmid(Epicentre)试剂盒构建宏基因组文库。按照试剂盒说明书，土壤DNA经末端修复酶修复、与pWEB载体连接、经λ-噬菌体包装后，每个克隆子可插入35-40kb的基因片段，于大肠杆菌E.coliEPI100中表达，将文库以大约5000个克隆子为单位分装成亚文库，加入15％甘油贮藏，以备筛选。在培养基中加入过膜后的阿魏酸甲酯作为筛选底物。将复制的文库进行适当稀释涂布，经培养后，观察筛选平板上是否出现相应的透明圈，并挑取能够产生透明圈的克隆子，将其接种于含有阿魏酸甲酯的LB液体培养基中过夜摇菌，取部分发酵液上清进行HPLC分析。若发酵液中存在阿魏酸，则证明该克隆子具有阿魏酸酯酶活性。提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，电泳后回收1-5kb大小的DNA片段，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coliDH5α。使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆。测定阳性亚克隆序列，获得阿魏酸酯酶编码基因fae-xuan。一种含有编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的表达载体。进一步的，所述表达载体源于pET-28a。一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括以下步骤：制备上述表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述重组阿魏酸酯酶。进一步的，具体步骤为，将编码新型阿魏酸酯酶的基因的PCR扩增产物经NcoI和HindIII双酶切，与pET-28a载体连接，得到pET-28a表达载体；用pET-28a表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物中分离纯化，获得重组阿魏酸酯酶。更进一步的，所述重组阿魏酸酯酶的制备方法：利用引物fae-f(5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’)和fae-r(5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’)扩增fae-xuan，上下游引物下划线处分别表示NcoI和HindIII的酶切位点。扩增片段经NcoI和HindIII双酶切后，连接至相同酶切的pET-28a表达载体中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。用于编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的特异性扩增的引物，包括以下两条序列：上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’(SEQIDNo.3)；下游引物：5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’(SEQIDNo.4)。上述新型阿魏酸酯酶在食品、制药和饲料工业中的应用。在食品、制药工业的应用中，由于阿魏酸广泛存在于植物的细胞壁中，可在阿魏酸酯酶的作用下从植物细胞壁中显著释放，释放出的阿魏酸可以作为抗氧化剂用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.编码权利要求1所述新型阿魏酸酯酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求2所述编码新型阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：提取土壤总DNA,构建cosmid宏基因组文库，利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码阿魏酸酯酶的基因。4.根据权利要求3所述的宏基因组学筛选方法，其特征在于，其具体步骤为，提取土壤总DNA,并纯化,构建cosmid宏基因组文库；利用底物筛选平板筛选阳性克隆子，HPLC验证其阿魏酸酯酶活性；提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coliDH5α；使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆，经测序和BlastP比较，从而筛选获得编码阿魏酸酯酶的基因。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的基因。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛志宏，李宣宣，郭佳，胡伊旻，南放，姜俊伟，杨雨蒙，吴盛露，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32