霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及饲用酶领域，具体涉及赤霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该酶能够水解玉米赤霉烯酮，去除毒素，在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

Mycophenone hydrolase ZEN214 and its encoding gene and its application

The invention relates to the field of feeding enzymes, specifically related to the ZEN214 and coding genes and applications of gibberenone hydrolase, as shown by the amino acid sequence, such as SEQ ID NO.1, which can hydrolyze zearalenone, remove toxins, and have broad prospects for application in animal mouldy feed and feed raw materials.

【技术实现步骤摘要】
霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用
本专利技术涉及饲用酶领域，具体涉及霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用。
技术介绍
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是世界上分布最广范的一种由镰刀菌产生的真菌毒素，在亚洲、欧洲和美洲等地的谷物及农副产品中均有发生。ZEN具有类雌激素性质，又称F-2毒素，其化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，分子式为C18H22O5，分子质量为318，熔点为165℃，对热较稳定，120℃加热4h不被降解。ZEN具有很强的生殖毒性，能够与雌激素受体产生竞争性结合继而表现出雌激素活性。雌激素受体与ZEN结合后受体构型发生改变，转移至细胞核中进一步与染色质结合，调节基因转录和蛋白质合成这两大过程，因此使细胞的分裂和生长受到影响。ZEN主要污染玉米、小麦、大麦等农作物和饲料，能引起猪、鸡等家畜或家禽早熟、生殖周期紊乱，给种养殖业带来巨大损失。ZEN还具有强致癌性，导致乳腺癌、食管癌等发病率增加，成为现今癌症发病率节节上升的原因之一。目前ZEN的检测方法已较为完善，但有关ZEN转化、降解等方面的问题迫在眉睫却仍悬而未决。ZEN污染范围广泛，危害程度严重，因此，有效控制和解决其对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有着非常重要的意义。近年来ZEN生物降解方法越来越受到重视。ZEN的生物降解方法主要是指微生物、植物或其代谢时产生的酶与ZEN发生作用并使ZEN分子结构中毒性基团被破坏从而生成无毒代谢产物的过程。由于微生物及其生物酶降解ZEN的方法能够彻底去除毒素，同时，该方法的专一性强、对饲料无污染、不会影响饲料营养价值，因此，该方法在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214。本专利技术的另一目的是提供编码上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的基因zen214。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的方法。本专利技术的另一目的是提供上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的应用。本专利技术合成了一种新的玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，并构建了能够高效表达此酶的重组大肠杆菌菌株。本专利技术提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，其氨基酸序列如下：SEQIDNO.1：MVFERLKSTVTTKDGIEWYYEQEGVGPHVVLIPDGLGECQMMDKPMSLIASAGFTVTTFDMPGMSRSSNAPVESYKGVTGHKLATQLDTLMEHLEIAKASFWGCSAGALAVLGLCAHYPSRVRNAMPHEAPLHLMDQLKDLPSLDDETLIASMAAISKASCRDDEAWNSLGPEVHQRLRRNFIRWAHGYISDLTLSPPIETENLRKRPISWTVGADSPMFMFFSNVVTATKADIPIKTLPGSHFPYVSHPEQMSKHIVEATRSHLP其中，该酶包括266个氨基酸，未预测到信号肽序列，该蛋白理论分子量为29.3kDa。本专利技术提供了编码上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的基因zen214，其编码基因经密码子优化后序列如下：SEQIDNO.2：atggttttcgaaagattgaagtctactgttactactaaagatggtattgagtggtactatgaacaagagggtgttggtccacatgttgttttgattcctgatggtttgggtgaatgtcaaatgatggataagccaatgtctttgattgcttctgctggttttactgttactactttcgatatgccaggaatgtctagatcttctaacgctcctgttgaatcttacaagggtgttactggtcataaattggctactcaattggatactttgatggaacacttggagattgctaaagcttctttttggggttgttctgctggtgctttggctgttttgggtttgtgtgctcactatccatctagagttagaaatgctatgccacatgaagctcctttgcacttgatggatcaattgaaggatttgccttctttggatgatgagactttgattgcttctatggctgctatttctaaagcttcttgtagagatgatgaagcttggaattctttgggtccagaggttcatcaaagattgagaagaaacttcatcagatgggctcacggttacatttctgatttgactttgtctccacctattgaaactgagaacttgagaaagagaccaatttcttggactgttggtgctgattctcctatgttcatgtttttctctaacgttgttactgctactaaggctgatatcccaattaaaactttgcctggtagtcatttcccatatgtttctcaccctgaacaaatgtctaaacatattgttgaggctactagatctcacttgccttaa本专利技术提供了包含上述赤霉烯酮水解酶基因zen214的重组载体，优选为pet30a-zen214。将本专利技术的赤霉烯酮水解酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将本专利技术的赤霉烯酮水解酶基因插入到质粒pet30a上的NdeI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pet30a-zen214。本专利技术还提供了包含上述赤霉烯酮水解酶基因zen214的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌BL21/zen214。本专利技术还提供了一种制备赤霉烯酮水解酶ZEN214的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组赤霉烯酮水解酶表达；3)回收并纯化所表达的赤霉烯酮水解酶ZEN214蛋白。根据本专利技术的具体实施方式，在大肠杆菌中表达赤霉烯酮水解酶。为了测定赤霉烯酮水解酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析的简单方法纯化赤霉烯酮水解酶。经过简单的净化，赤霉烯酮水解酶的纯度足以研究酶学性质的研究。本专利技术还提供了上述赤霉烯酮水解酶ZEN214的应用，包括生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。组表达的赤霉烯酮水解酶ZEN214具有宽泛的pH范围，在pH5.0-9.0均具有较好的水解能力，其最适温度范围为35-40摄氏度。附图说明图1显示赤霉烯酮水解酶的SDS-PAGE分析结果。图2显示赤霉烯酮水解酶降解玉米赤霉烯酮底物HPLC分析结果。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：本专利技术的赤霉烯酮水解酶ZEN214的编码基因(SEQIDNO.2)在金斯瑞公司合成。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.玉米赤霉烯酮水解酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214。3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2所述玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，柏映国，杨虹，罗会颖，陈家明，涂涛，孟昆，王亚茹，黄火清，苏小运，王苑，马锐，师霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11