一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；通过优化碳源种类、添加微粒等方式控制构巢曲霉发酵过程中的菌丝体形态，使菌丝体呈现小球状，使发酵中因菌丝体长度过长导致的粘度高、溶氧低、传质不充分等问题得到解决；通过分析ECB合成过程中关键代谢组分，优化发酵过程中的前体添加策略，使发酵产物产量进一步提高一倍以上，具有很好的应用前景。

A method for fermentation of high yield acanthomycin B by Aspergillus oryzae

The invention discloses a method for fermenting high yield acanthomycin B by Aspergillus oryzae. The method is as follows: inoculating Aspergillus oryzae to fermentation medium and cultivating the fermentation broth containing acanthomycin B at 25 C, separating and purifying the fermentation broth, obtaining acanthoxin B, and controlling the species of carbon source and adding particles. The mycelial form of Aspergillus formation in the process of Aspergillus formation makes the mycelium appear small spheroid, so that the problems of high viscosity, low dissolved oxygen and insufficient mass transfer caused by long mycelium length in the fermentation are solved. By analyzing the key metabolic components in the ECB synthesis process, the strategy of adding the precursor in the fermentation process is optimized to make the fermentation product. The yield is more than doubled, so it has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法(一)
本专利技术涉及一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法。(二)
技术介绍
丝状真菌发酵过程中，其菌丝形态受生长条件及培养环境的影响，随着培养条件、培养基组成等的变化，菌丝形态会出现不同的类型，如无分支的菌丝、有分支且结构复杂的菌丝、菌丝团块、菌丝球等，表现出不同大小、密度及表面结构。此外，随时间变化，不同生长时期的菌丝体内部结构也会发生改变。丝状真菌在液体深层发酵中菌丝体通常呈现絮状、团状和球状三种形态。菌丝体形态对发酵液的粘度等影响较大，菌丝体形态不同，其产物也会发生改变，因此，在丝状真菌发酵过程中需要将其控制在最佳菌丝体形态，以利于目标产物的代谢合成。在发酵生产过程中，丝状真菌菌丝若形成絮状的菌丝体，会造成发酵液粘度增大，不利于营养物质和氧气的溶解、传递及分布，从而降低好氧发酵产物的产量，严重时会导致产物产率极低；若菌丝体形态呈现紧密的团块状，在团块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成团块内部菌丝体发生自溶现象。深层液体发酵的孢子萌发出菌丝及菌丝延长的过程中，在孢子聚集及机械搅拌作用下，发酵液中的菌丝还可以形成大小适中的菌丝球，此时发酵液的传递效果好，菌丝体生长旺盛，目标代谢产物合成效率高。可以说菌丝体形态是工业发酵中获得目标产物产量最大化的主要影响因素。目前国内外棘白菌素B(ECB)均是利用微生物发酵法进行制备，其中主要是以构巢曲霉Aspergillusnidulans进行发酵。但是该类微生物发酵过程中会碰到一些难以克服的技术问题，如发酵液粘度过高，供养不足以及传质受阻等，这些问题都会导致菌种代谢合成产物的能力下降，因此ECB发酵仍然处于实验研究阶段。要解决上述问题，常用的方法有菌种诱变、培养基优化、气升式发酵罐培养、细胞固定化以及工艺操作条件调控等。近年来，研究学者提出了通过改变发酵培养基成分以及添加外源无机微粒的方式影响丝状微生物生长过程中的菌体形态，并进一步影响产物产量及酶的活性，因此选择合适的方法改变棘白菌素B菌株发酵过程中的菌体形态对实现棘白菌素B发酵生产具有较大的社会和经济效益。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，提供一种控制构巢曲霉发酵菌株A.nidulansZJB09223菌体形态的发酵培养基，以克服棘白菌素B发酵过程中发酵液粘度过高，溶氧传质受阻的缺陷，然后对该培养基进行前体氨基酸添加的优化，进一步提高棘白菌素B发酵产量。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；所述发酵培养基终浓度组成为：碳源54～134g/L，氨基酸0.1～12g/L，蛋白胨8.6g/L，黄豆饼粉40.0g/L，花生油20.0g/L，K2HPO4·3H2O3.2g/L，CaCl20.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.5g/L，MnSO4·H2O0.2g/L，CuSO4·5H2O0.6g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6～6.8，所述碳源为甘露醇、葡萄糖、甘油或油酸甲酯。进一步，所述发酵培养基中碳源为油酸甲酯，添加量为54～134g/L，优选114g/L。进一步，所述发酵培养基中氨基酸为L-苏氨酸、L-鸟氨酸中的一种或两种的混合。进一步，所述发酵培养基中氨基酸由终浓度0.1～4.1g/L的L-苏氨酸和终浓度6.1g/L的L-鸟氨酸组成。进一步，所述发酵培养基中氨基酸由终浓度2.1g/L的L-苏氨酸和终浓度6.1g/L的L-鸟氨酸组成。进一步，所述L-苏氨酸在发酵第6-7天的时候加入。进一步，所述发酵培养基还含有微粒，所述微粒为玻璃珠或滑石粉。进一步，所述玻璃珠直径为2mm，添加量为10颗/L培养基。进一步，所述滑石粉粒径为300-800目(优选325目)，添加量为10-50g/L培养基(优选20g/L)。进一步，所述发酵培养基终浓度优选组成为：325目滑石粉20g/L，油酸甲酯114g/L，L-苏氨酸3.1g/L，L-鸟氨酸6.1g/L，蛋白胨8.6g/L，黄豆饼粉40.0g/L，花生油20.0g/L，K2HPO4·3H2O3.2g/L，CaCl20.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.5g/L，MnSO4·H2O0.2g/L，CuSO4·5H2O0.6g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6.68。所述构巢曲霉优选构巢曲霉发酵菌株A.nidulansZJB09223(CCTCCM2012300，已在专利申请CN103509840A，CN201310478251.6中公开)。本专利技术发酵培养基能够控制构巢曲霉在发酵过程中的菌体形态，提高和稳定ECB发酵产量。所述氨基酸检测方法如下：发酵液取样后迅速加入-40℃的50％甲醇进行淬灭，超声破碎菌体，超纯水稀释一定倍数，离心，取上清用于氨基酸含量分析。经过实施例中的各碳源对比发现葡萄糖，甘油，甘露醇作为碳源菌体生长状态较差，溶液粘稠，不利于产物生成；而优化的碳源为油酸甲酯，以油酸甲酯为碳源相对于其他三者效果较好；微粒中以滑石粉和玻璃珠两者为对照，其中玻璃珠的添加与滑石粉对比，产物效价较低；氨基酸的添加是有针对性地改变ECB合成路径中氨基酸代谢途径的相关氨基酸含量，相关氨基酸最为关键的为苏氨酸。本专利技术的有益效果主要体现在：通过优化碳源种类、添加微粒等方式控制构巢曲霉发酵过程中的菌丝体形态，使菌丝体呈现小球状，使发酵中因菌丝体长度过长导致的粘度高、溶氧低、传质不充分等问题得到解决；通过分析ECB合成过程中关键代谢组分，优化发酵过程中的前体添加策略，使发酵产物产量进一步提高一倍以上，具有很好的应用前景。(四)附图说明图1为添加不同碳源时的菌体形态。图2为添加不同无机微粒时的菌体形态。图3为未添加前体氨基酸发酵培养基中第七天氨基酸分析图。图4为添加前体氨基酸发酵培养基中第七天氨基酸分析图。图5为优化后的发酵培养基棘白菌素B的HPLC图谱。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：构巢曲霉A.nidulansZJB09223发酵制备棘白菌素B(ECB)用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉A.nidulansZJB09223(CCTCCM2012300，已在专利申请CN103509840A，CN201310478251.6中公开)平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基(g/L)配制：黄豆饼粉25，葡萄糖10，甘油10，溶剂为蒸馏水，pH值自然，115℃灭菌30min。为了考察培养基中单一碳源对ECB发酵水平和菌体形态的影响，设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：发酵培养基(g/L)I(原始培养基)：甘露醇97，甘油10.0，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，L-苏氨酸2.1，L-鸟氨酸6.1，K2HPO4·3H2O3.2，CaCl20.5，MgSO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，其特征在于所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；所述发酵培养基终浓度组成为：碳源54～134g/L，氨基酸0.1～12g/L，蛋白胨8.6g/L，黄豆饼粉40.0g/L，花生油20.0g/L，K2HPO4·3H2O 3.2g/L，CaCl2 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，CuSO4·5H2O 0.6g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6～6.8，所述碳源为甘露醇、葡萄糖、甘油或油酸甲酯中的一种或两种任意比例的混合。

【技术特征摘要】
1.一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，其特征在于所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；所述发酵培养基终浓度组成为：碳源54～134g/L，氨基酸0.1～12g/L，蛋白胨8.6g/L，黄豆饼粉40.0g/L，花生油20.0g/L，K2HPO4·3H2O3.2g/L，CaCl20.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.5g/L，MnSO4·H2O0.2g/L，CuSO4·5H2O0.6g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6～6.8，所述碳源为甘露醇、葡萄糖、甘油或油酸甲酯中的一种或两种任意比例的混合。2.如权利要求1所述利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，其特征在于所述发酵培养基中碳源为油酸甲酯。3.如权利要求1所述利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，其特征在于所述发酵培养基中氨基酸为L-苏氨酸、L-鸟氨酸中的一种或两种任意比例的混合。4.如权利要求1所述利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，其特征在于所述发酵培养基中氨基酸由终浓度0.1～4.1g/L的L-苏氨酸和终浓度6.1g/L的L-鸟氨酸组成。5.如权利要求1所述利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，牛坤，胡晓龙，邹树平，吴旭萍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33