一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺，所述工艺通过在BMGY培养基中进行一级种子液的培养，再通过将一级种子液接种于添加了0.4%微量元素溶液的无机盐培养基中进行二级种子的培养，然后将二级种子液再次接种在添加了0.4%微量元素溶液的无机盐培养基中高密度发酵培养，得高表达量，纯度高的所述死亡素抗菌肽；该工艺操作简单、转化率高，适合大规模生产。

Production technology of recombinant death hormone by Pichia pastoris fermentation

The invention discloses a production process for the fermentation of recombinant death in Pichia pastoris, which is cultivated in the first stage seed liquid in the BMGY medium, and then is cultured in the inorganic salt medium of the 0.4% trace element solution by inoculating the first seed liquid in the inorganic salt medium adding the 0.4% trace element solution, and then the seed liquid of the two stage is reproduced. The secondary inoculation was used in high density fermentation in inorganic salt medium with 0.4% trace element solution, which had high expression and high purity. The process was simple, high conversion rate and suitable for large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺
本专利技术涉及生物发酵领域，特别涉及一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺。
技术介绍
死亡素（Thanatin），又称死亡肽，是由斑腹刺益蝽（Podisusmaculiventris）诱导产生的一种环状昆虫抗菌肽，由21个氨基酸残疾组成，其结构简单，抗菌谱广，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、某些真菌及原虫都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性。鉴于死亡素具有优越的广谱抗菌活性，及独特的作用方式，是一种理想的抗生素替代产品，具有广阔的应用前景。目前多数研究者采用融合表达策略在大肠杆菌表达系统中进行表达，也有尝试利用裂殖酵母表达系统表达死亡素，但是这两种方法死亡素抗菌肽的表达量都很低，无法满足大规模生产和广泛应用的要求。可见，现有技术还有待改进和提高。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺，旨在实现死亡素的大规模发酵生产，降低生产成本。为了达到上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺,包括以下步骤：A.一级种子的培养：配制BMGY培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺,其特征在于，包括以下步骤：A.一级种子的培养：配制BMGY培养基，121℃灭菌20min，冷却至室温，在超净工作台中将死亡素菌种接种至BMGY培养基中，30±0.5℃摇床培养15‑28h，转速200‑250rpm，菌体浓度OD600=5‑10，得一级种子液；B.二级种子的培养：配制无机盐培养基，对培养基进行灭菌后添加0.4%微量元素溶液，用氨水调节PH为5.0‑5.2，镜检一级种子液，合格后将一级种子液接种于无机盐培养基中，30±0.5℃培养8‑24h后得二级种子液；C.发酵罐高密度发酵：配制无机盐培养基于发酵罐中，添加0.4%微量元素溶液，121℃灭...

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺,其特征在于，包括以下步骤：A.一级种子的培养：配制BMGY培养基，121℃灭菌20min，冷却至室温，在超净工作台中将死亡素菌种接种至BMGY培养基中，30±0.5℃摇床培养15-28h，转速200-250rpm，菌体浓度OD600=5-10，得一级种子液；B.二级种子的培养：配制无机盐培养基，对培养基进行灭菌后添加0.4%微量元素溶液，用氨水调节PH为5.0-5.2，镜检一级种子液，合格后将一级种子液接种于无机盐培养基中，30±0.5℃培养8-24h后得二级种子液；C.发酵罐高密度发酵：配制无机盐培养基于发酵罐中，添加0.4%微量元素溶液，121℃灭菌30min，用氨水调节PH5.0-5.2，镜检二级种子液，合格后将二级种子液接种至发酵罐中，通气量1.0-1.2vvm，溶氧大于20%，当溶氧快速上升，补加甘油，控制溶氧大于20%，菌体湿重大于300g/L时，停止流加甘油，饥饿0.5-1h后，用甲醇诱导死亡素表达，诱导120h结束。2.根据权利要求1所述的毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺，其特征在于，所述的步骤A还包括将镜检后的一级种子液在火焰造成局部无菌环境下接种于经过121-123℃灭菌30min的培养罐中，培养温度30±0.5℃，PH5.0-5.2，罐压0.04-0.05MPa，通气量1.0-1.2vvm，溶氧大于20%，培养14-16h，至菌体湿重大于...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁伟凡，周玉岩，丁小云，林绿淼，李洪金，丘春尚，
申请(专利权)人：广东海纳川生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44