本申请涉及KLOTHO蛋白在评估胃肠道间质瘤危险度中的用途。具体地，本发明专利技术提供了一种KLOTHO蛋白在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明专利技术具有如下技术效果：由于胃肠道间质瘤患者，其间质瘤的危险度分级越高，间质瘤组织中KLOTHO蛋白表达阳性率越高，通过检测个体间质瘤组织中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达预测胃肠道间质瘤的危险度。
【技术实现步骤摘要】
KLOTHO蛋白在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途
本专利技术涉及医学、临床诊断领域。具体而言，涉及一种KLOTHO蛋白作为标记物在诊断胃肠道间质瘤危险度方面的用途。
技术介绍
胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor，GIST)是一类起源于胃肠道的间叶源性肿瘤，与传统意义上的恶性肿瘤与癌症不同，其生物学行为和临床表现复杂多样，跨度覆盖良性、低度恶性、中度恶性、高度恶性，因此GISTs患者的预后亦差异很大，良性GISTs可以终生无任何进展，而高度恶性GISTs生长极快，预后极差。对于GISTs危险度的判断，目前普遍采用的是美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)危险度分级，即主要依据肿瘤大小、核分裂相以及肿瘤原发部位进行判断，缺乏分子指标。Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13q12，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成。Koltho基因的cDNA含有二段不同的片段，分别编码二种不同的蛋白：一为膜型，位于细胞膜上，其胞外区的蛋白序列与β-葡萄糖苷酶相似；二为分泌型，存在于血液循环中，被认为是一种肽类激素。Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等。近年来，越来越多的研究发现klotho基因在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似“抑癌基因”的重要作用。对现有技术的国内外文献和专利进行检索，至今未见任何klotho与胃肠道间质瘤之间相关性的研究报道，更无任何KLOTHO蛋白及其相关组成成分用于胃肠道间质瘤诊断和治疗的研究报道。根据我们的研究结果，GISTs患者的间质瘤组织中，KLOTHO蛋白表达阳性率与GISTs的危险度分级呈正相关，提示klotho基因可能参与促进GISTs从良性到恶性的转化。这一研究结果与现有的研究认为“klotho具有类似抑癌基因样作用”恰恰相反，提示klotho在GISTs中的功能有其特殊性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于填补现有klotho基因应用的空白，也填补了胃肠道间质瘤的危险程度判断缺乏分子指标的空白，即一种KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途。本专利技术旨在提供一种诊断胃肠道间质瘤危险度的方法，从而辅助胃肠道间质瘤的治疗。鉴于本领域的上述要求，本专利技术的一些实施方式提供了确定受试者样本中klotho表达水平的试剂在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途。在一些实施方式中，在蛋白水平确定klotho的表达水平。当在蛋白的表达水平确定为KLOTHO的表达水平时，可用的试剂是抗KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体。多克隆抗体或单克隆抗体均可用于实施本公开的技术方案。在具体的实施方式中，利用免疫组化的原理，采用抗KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体确定KLOTHO蛋白的表达水平。在另一些实施方式中，在基因水平确定klotho的表达水平。当在基因水平确定为klotho的表达水平时，可用的试剂是探针或引物对。技术人员可根据klotho的核苷酸序列自行制备特异性的探针或引物对。在一些实施方式中，受试者样本为胃肠间质瘤组织样本。胃肠间质瘤组织可以通过活检的方式获得，或者通过内镜切除的方式获得，或者通过外科手术的方式获得。在一些实施方式中，胃肠道间质瘤危险度分级是指极低度(良性)、低度、中度、高度恶性。附图说明图1a为极低危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×10)；图1b为极低危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×300)；图2a为高危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×10)；图2b为高危险度GISTs中KLOTHO蛋白免疫组化染色结果(×300)；具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术。需注意的是，以下实施例只用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。下列实施例中提到的KLOTHO蛋白均为氨基酸序列如SEQNO.1所示的KLOTHO蛋白。实施例1GISTs组织中KLOTHO蛋白表达的临床意义(一)临床病理样本用于检测的GISTs样本是由90例GISTs组织组成的组织芯片，购置自上海芯超生物有限公司，货号HDgS-GIST090Loc-01，配套相关临床病理资料。(二)实验方法采用免疫组化S-P法，检测KLOTHO蛋白在由90例GISTs组织组成的组织芯片中的表达情况。步骤如下：1.将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。2.配制试剂：2.110*PBS缓冲液(配方：80gNaCl、2gKCl、15.35gNa2HPO4、2gKH2PO4，用纯水定容至1000毫升)：将10*PBS缓冲液稀释至1*PBS缓冲液，再在1*PBS缓冲液中加入占总体积0.05％的吐温试剂；2.2抗原修复液柠檬酸修复液：82毫升0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；EDTA修复液：PH＝9.0的50*EDTA抗原修复液(迈新)用纯水稀释50倍。3.片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；90％酒精1缸，7分钟；80％酒精1缸，7分钟；70％酒精1缸，7分钟；4.从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次3分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电炉上开始加热；5.抗原修复柠檬酸高压修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却30分钟；EDTA热修复：加热沸腾后放入片子，计时20分钟。6.配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4ml无水甲醇+12ml30％浓度的H2O2+9.6ml纯水；7.将片子放入阻断剂中10分钟。8.取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；9.冰箱中取出KLOTHO抗体[SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.Klotho(T-19:s-22218)]，放入离心机里7200转离心30秒；10.取出抗体，按照稀释度用DAKO抗体稀释液稀释；11.滴加抗体；12.将湿盒放入冰箱，4℃过夜。13.从冰箱里取出湿盒，静置1小时待其恢复到室温；14.将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；15.滴加EnVisionTM+/HRP鼠工作液(来自DAKO公司)，30分钟；16.时间到后用PBS冲洗3次，一次5分钟。17.从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)18.在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗15分钟。19.在片子上滴加苏木素2分钟，时间到后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；20.将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。脱水过程：75％酒精1缸，3分钟；85％酒精1缸，3分钟；95％酒本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.KLOTHO蛋白或其可溶性蛋白片段在制备诊断胃肠道间质瘤危险度的试剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄曙，林洁，王敏，朱苏敏，
申请(专利权)人：黄曙，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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