基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器制造技术

本发明专利技术提供了一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。首先将分散在壳聚糖溶液中的氢氧化铜纳米材料修饰到环氧硅烷化的载玻片反应阵列中；随后将链霉亲和素固定在氢氧化铜纳米材料表面；再通过链霉亲和素对生物素特异性识别来固定多种生物素化抗体，牛血清蛋白封闭非特异性位点后即制得多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶具有易合成，比表面积大，可媲美天然酶的催化活性等优势，改善了天然酶稳定性差，来源有限，易受环境影响等缺点，应用于构建传感器显示出了卓越的灵敏度，稳定性。

Multi component unlabeled chemiluminescent imaging array sensor based on three-dimensional cage type copper hydroxide mimetic enzyme

The invention provides a multi component unlabeled chemiluminescent imaging immune array sensor based on three-dimensional cage type copper hydroxide nano mimetic enzyme. First, the copper hydroxide nanomaterials dispersed in the chitosan solution were modified into the epoxy silanized slide reaction array, and then streptomycin was immobilized on the surface of the copper hydroxide nanomaterial, and a variety of biotinylated antibodies were immobilized by the streptavidin on the biotin specificity. A multi component unlabeled chemiluminescent imaging array sensor was developed after heterosexual sites. The three dimensional caged cupro nanoscale analogue enzyme has the advantages of easy synthesis, large specific surface area, comparable to the catalytic activity of natural enzyme, and improved the poor stability of natural enzyme, limited source and easy to be affected by the environment. It has been applied in the construction of sensors to show excellent sensitivity and stability.

【技术实现步骤摘要】
基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器
本专利技术涉及免疫学领域、化学发光分析、肿瘤标志物检测和多组分免疫分析等领域，具体涉及了一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。
技术介绍
上世纪70年代中期Arakawe首先报道了化学发光分析，发展至今已成为一种超微量活性物质检测技术，是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和成熟的检测方法之一。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，同时具有化学发光的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。指利用化学发光系统作为免疫反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法。近年来，无标记免疫分析受到人们的普遍关注与研究，在疾病检测、药物分析、环境监测和食品安全检测等方面已得到了广泛的应用。无标记免疫分析是指检测过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，样品消耗少，分析速度快，操作简单等显著优势，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析。在此我们使用包埋法将三维笼型氢氧化铜固定于传感器界面以实现无标记免疫分析。传统的化学发光免疫分析中常以辣根过氧化物酶（HRP）作为标记物来催化鲁米诺-过氧化氢体系发光从而实现高灵敏检测。但天然酶具有稳定性差、提取困难、来源有限等缺点制约了它的生产和应用。相对于天然酶，人工合成具有似过氧化物酶活性的模拟酶具有比表面积大、易于功能化、稳定性好等优势。近年来，越来越多的纳米模拟酶被合成应用，主要包括金属纳米颗粒、碳纳米材料、磁性颗粒、量子点以及这些纳米材料的复合物等。在此，我们合成了一种三维笼型氢氧化铜，尺寸大小为150~200nm，是一种具有内源性模拟酶活性的纳米材料。三维笼型氢氧化铜的合成方法简单且在常温下即可合成，由纳米针状氢氧化铜自组装形成的三维笼型氢氧化铜，其三维结构是由针状氢氧化铜组装而成，因此其比表面积很大且铜离子的似过氧化物酶活性好，因此三维笼型氢氧化铜其催化活性可与天然酶媲美，且大大改善了天然酶固有的缺陷，但尚未应用到化学发光免疫分析领域中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。其基本思路是：首先将用壳聚糖溶液等体积分散的三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶包埋于丝网印刷环氧硅烷化载玻片的免疫微孔表面；然后将链霉亲和素覆盖涂布于三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜上；再借助链霉亲和素对生物素的特异性识别特性来固定多种生物素化抗体；随后用牛血清蛋白封闭液以封闭非特异性位点后即成功构建多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。当在传感器界面修饰多组分抗原样品，最后滴入化学发光底物。抗原与抗体特异性反应所形成的免疫复合物会阻碍三维笼型氢氧化铜模拟酶对化学发光底物的催化作用，从而导致化学发光信号减弱。为了达到上述目的，本专利技术技术方案如下：本专利技术提供了一种基于三维笼型氢氧化铜的多组肿瘤标记物无标记化学发光免疫传感器。在丝网印刷载玻片的免疫微孔阵列表面成功构建化学发光免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化层作为载体连接层；纳米模拟酶-壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；生物素化抗体层作为免疫反应识别层。进一步地，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成多个微孔的免疫微孔阵列。更进一步地，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列。本专利技术还提供了一种构建基于三维笼型氢氧化铜的多组分无标记化学发光免疫阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）将可抛式载玻片浸泡于水虎鱼酸溶液中活化使其表面暴露有羟基，去离子水冲洗并晾干后，再浸泡于含有1%GPTMS的甲苯溶液中使其硅烷化，先用甲苯后用乙醇冲洗，自然晾干，制成环氧硅烷化载玻片。（2）利用丝网印刷技术并借助模板将环氧硅烷化载玻片印刷成四排*十二列格式即具有48个免疫微孔的反应阵列。（3）将氢氧化铜纳米材料超声分散于去离子水中，壳聚糖溶液与氢氧化铜溶液等体积混合并震荡均匀，将该混合液滴涂于环氧硅烷化微孔阵列中，室温晾干即得含有三维笼型氢氧化铜模拟酶的壳聚糖膜；（4）在上述三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜表面覆盖滴上链霉亲和素，在室温下反应，再放置于3℃下晾干；（5）将多组分的生物素化抗体滴涂于链霉亲和素功能化的四列免疫微孔阵列的表面，即可通过链霉亲和素特异性识别生物素而成功修饰多组分抗体。温育一段时间后，用磷酸盐缓冲溶液小心冲洗载玻片，然后在氮气氛围下吹干；（6）将牛血清蛋白封闭缓冲溶液滴涂于上述成功修饰多组分抗体的微孔中，在3℃下封闭。用磷酸盐缓冲溶液小心冲洗载玻片，然后在氮气氛围下吹干，即制得多组分无标记免疫阵列传感器。其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（1）中，水虎鱼酸溶液是体积比7：3的H2SO4和H2O2组成，活化8~12小时。含有1%GPTMS的甲苯溶液需浸泡过夜以完成硅烷化；其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（2）中，借助模板印刷油漆形成疏水性无光活性膜，膜内微孔直径2mm，边缘间距4mm。其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（3）中，三维笼型氢氧化铜浓度为0.5~2.0mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为0.5~1.5wt%。其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（4）中，链霉亲和素溶液的浓度为50~200μg/mL。其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（5）中，生物素化抗体的浓度为1.0~5.0μg/mL，放置于室温下温育3小时其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（6）中，牛血清蛋白封闭溶液的浓度为10~50mg/mL，保鲜密封于3℃下封闭过夜。本专利技术达到了如下有益效果：本专利技术成功构建了一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，首先借助环氧硅烷化的丝网印刷载玻片表面制作了高通量免疫微孔阵列；将壳聚糖分散的三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶溶液包埋于微孔中；然后链霉亲和素覆盖于氢氧化铜-壳聚糖膜表面；借助链霉亲和素对生物素的特异性识别从而有效地固定多种生物素化抗体；最后用牛血清蛋白封闭非特异性位点后即成功制备多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。在传感器界面温育上相对应的肿瘤标志物抗原，利用电感耦合CCD即能同时检测多组分肿瘤标志物的化学发光信号，因此提供了一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器的制备方法。本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化载玻片上制成可抛式化学发光成像免疫微孔阵列，是能够提供多组分肿瘤标志物同时检测的阵列。多组分检测的优势不仅仅在于其极大简化操作过程，具有分析通量高、所需时间短、样品消耗少、分析成本低等显著优势，而且多组分肿瘤标志物同时检测能够大大提升诊断的准确性。（2）本专利技术所合成材料是有针状氢氧化铜纳米材料自组装形成的三维笼型氢氧化铜，尺寸大小为150~200nm，由针状氢氧化铜自组装形成的三维结构具有很大的比表面积，而且合成方法简单，材料价格低廉，稳定性好。三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶具备内源性模拟酶性质且因其三维结构更增强了其催化活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，在丝网印刷载玻片的免疫微孔阵列表面成功构建化学发光免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化层作为载体连接层；纳米模拟酶‑壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；生物素化抗体层作为免疫反应识别层。

【技术特征摘要】
1.一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，在丝网印刷载玻片的免疫微孔阵列表面成功构建化学发光免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化层作为载体连接层；纳米模拟酶-壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；生物素化抗体层作为免疫反应识别层。2.根据权利要求1所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成多个微孔的免疫微孔阵列。3.根据权利要求2所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列。4.根据权利要求1所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述三维笼型氢氧化铜纳米粒子的制备方法，其特征包括以下步骤：（1）将二水合硫化铜（34mg）、聚乙烯吡咯烷酮K30（261mg）、无水乙醇（80mL）依次加入250mL三口烧瓶，10分钟超声，30分钟搅拌；（2）15.4mg硼氢化钠溶入20mL无水乙醇后在剧烈搅拌条件下快速加入到溶液中，剧烈搅拌72小时；（3）离心收集并用无水乙醇洗涤干净即得无定型氢氧化铜纳米材料；（4）取步骤（3）所制备的无定型氢氧化铜纳米材料（9.7mg）和聚乙烯吡咯烷酮K90（20mg）加入100mL三口烧瓶中超声30分钟以分散在20mL蒸馏水中；（5）铜-氨混合溶液的制备是有5mL三水合硝酸铜（24.16mg）水溶液和15mL氨水（400μL氨水（29%）和14.6mL蒸馏水）混合而成，取铜-氨混合溶液（20mL）在一分钟内加入（4）中分散好的三口烧瓶中并剧烈搅拌10分钟；（6）通过离心收集产品并依次用丙酮和甲醇洗涤干净即制备得三维笼型氢氧化铜模拟酶。5.一种制备如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，钟艺红，蓝庆春，吴昕玥，胡锐宣，刘珊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32