ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药的方法技术

本发明专利技术公开了ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药的方法。本发明专利技术首先对胃肠道间质瘤患者外周血浆或血清进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中C‑kit或PDGFRα的耐药突变位点T670I、D816V或D842V的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术首先对胃肠道间质瘤患者外周血浆或血清进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中C?kit或PDGFRα的耐药突变位点T670I、D816V或D842V的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。【专利说明】ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼 耐药的方法
本专利技术涉及医学和生物
，具体地涉及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技 术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆或血清中c-kit基因（T670I、D816V)/roGFRa基因 (D842V)突变及其在监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药性等方面的应用。
技术介绍
胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GIST)是消化道最常见的间 叶来源肿瘤，它的生物学行为复杂多变。GIST对传统放化疗不敏感，既往手术是GIST唯一 有效的治疗方法。今年来，分子靶向研究在胃肠道间质瘤方面取得巨大进步，酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼（imatinib)可显著改善晚期GIST患者的临床预后，并且副反应轻微，耐受良 好。伊马替尼已成为不能手术切除和复发转移的GIST患者的一线治疗方案。然而，随着 伊马替尼治疗时间的延长，继发耐药问题逐渐凸显，成为临床的棘手问题，研究表明，晚期 GIST经过伊马替尼治疗后，50%的患者在2年内出现进展，最终所有的患者都会产生耐药 而出现疾病进展。 伊马替尼继发耐药是指经药物治疗6个月后才出现肿瘤进展者。继发耐药最常见 的机制是基因的二次突变。伊马替尼是通过与ATP竞争结合于胞内酶活性区而抑制KIT激 酶，因此二次突变使得ATP结合位产生异常直接或间接导致伊马替尼耐药。研究表明，kit 第11外显子原发突变的GIST较易出现kit继发突变，kit第14和17号外显子突变型GIST 患者对伊马替尼会产生继发性耐药，kit野生型肿瘤尚未发现kit继发性突变者。TOGFRα 第14外显子突变的病人较易产生第18外显子D842V突变；也有kit第11外显子原发突变 的GIST出现继发TOGFR α第18外显子突变。 对于复发和转移，伊马替尼治疗后继发耐药的晚期GIST，目前有效的治疗方法包 括增加伊马替尼剂量，手术治疗，或换用其他靶向药物，如舒尼替尼。舒尼替尼（Sunitinib， Sutent)是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物。舒尼替尼的首要开发目标为用于治 疗对标准疗法没有响应或不能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌，舒尼替尼能选择 性地靶向某些蛋白的受体，后者被认为在肿瘤生长过程中起着一种分子开关样的作用。舒 尼替尼的上述适应证已在美国获得了 FDA授予的"快通道"审批地位。 然而近年来有研究发现，利用传统的一代测序和ARMS-PCR平台检测C-kit/ TOGFRa基因突变常出现假阴性的结果，对指导用药并不十分准确，使得一些患者错过了最 好的治疗时机，因此需要一种更灵敏更准确的检测C-kit/TOGFRa基因突变的方法，以指 导患者对靶向药物的使用。 血浆游离DNA (cfDNA)含有循环肿瘤DNA (ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和 定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监 控肿瘤负荷的可靠指标。cf DNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。 研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片段的双链 DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。 然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高 效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段（如测序、数字PCR)，仍难以准 确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠 癌患者中循环游离DNA的平均含量（4771ng/ml)与健康人的平均含量（0.85ng/ml)存在显 著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原（CEA)的检测只有47%检测结果对诊断有意义。 因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令 人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。 综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和 高可靠性地检测患者中肿瘤相关突变（如C-kit T670I突变、C-kit D816V突变、或 PDGFR a D842V突变）的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够用非肿瘤组织（如血液或血浆样品）检测患者 C-kit 基因（T670I、D816V)/roGFRa 基因（D842V)突变的方法。 本专利技术的第一方面，提供了一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，包括步 骤： (1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本、血清样本或血液样品； (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其 中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于 30ng/微升的提取液； (3)以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR (ddPCR)，从而获 得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和 (4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比 例； 且所述的基因选自下组：C-kit基因，或TOGFRa基因。 在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：C-kit T670I、C-kit D816V、或 PDGFRa D842V。 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。 在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本。 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。 在另一优选例中，所述的检测样本是血清样本。 在另一优选例中，所述的血清样本是用外周血样本经预处理获得。 在另一优选例中，所述的预处理包括： (a)将采集的外周血至于非肝素的抗凝管（如EDTA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝 管）中； (b)经一级离心处理，去除沉淀，分离获得液相（血浆）； (c)对上一步骤的获得的液相进行二级离心，去除沉淀，分离获得液相作为用于提 取DNA的检测样本。 在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件： (b-i)2000-5000rmp ； (b-ii)离心约 1-15 分钟； (b-i i i)温度 0-8Γ，较佳地 4 ± 2Γ。 在另一优选例中，所述的一级离心包括选自下组的一个或多个条件： (c-i) 10000-15000rmp ； (c-ii)离心约 5-30 分钟； (c-i i i)温度 0-8°C，较佳地 4 ± 2°C。 在另一优选例中，所述的血清样本是用外周血样本经预处理获得。 在另一优选例中，所述的预处理包括： (i)将外周血样本置于促凝管中； (ii)在室温下，对所述的样本进行自然沉降（优选为l_3h); (iii)对所述沉降后的样本进行离心（优选为2000-4000rmp下离心l-15min),分 离上清液，得到血清。 在另一优选例中，所述的预处理包括： (i)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本、血清样本或血液样品；(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20‑100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液；(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出基因耐药突变位点的突变形式和/或比例；且所述的基因选自下组：C‑kit基因，或PDGFRα基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：易静，许骋，吴云鸣，张桢珍，丁飞飞，楼敬伟，何青卿，马国栋，周箴，刘晓晨，张存，李迎雪，
申请(专利权)人：上海宝藤生物医药科技股份有限公司，上海张江转化医学研发中心有限公司，上海宝藤医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31