一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型生物质谱相对定量方法技术

本发明专利技术涉及一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。本发明专利技术相方法对每种DNMT亚型利用多种特异性肽段同时进行分析和定量，消除样品处理及测定所带来的误差，提高方法准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型生物质谱相对定量方法
本专利技术涉及蛋白质组学
，尤其是涉及一种同时测定斑马鱼的7种DNMT的质谱绝对定量方法。
技术介绍
DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制，是表观遗传学的重要事件，在细胞分化与增殖、生物体老化、肿瘤发生等多种重要生命活动中具有重要作用。斑马鱼作为一种经典的科研模式生物，其具有与人体相似的DNA甲基化酶系统，较为准确地反映出DNA甲基化生命现象的本质和机制。而DNA甲基化酶是甲基基团从供体向DNA转移的重要催化酶，准确定量DNA甲基化酶水平及为表观遗传学研究提供重要基础。现有蛋白定量分析方法主要有基因探针法，WesternBlot法，ELISA法以及mRNA检测法等。然而上述方法中WesternBlot法和ELISA中专一性的抗体不易制备；由于mRNA翻译为蛋白质受到翻译调控影响，基因探针法和mRNA法均是从基因表达定量层面间接反映蛋白质水平的方法均无法真实定量蛋白质含量。以上方法无法满足表观遗传学研究的要求。近年来多反应监测技术（MRM）逐渐发展起来，这是一种基于LC/MS/MS的方法，根据已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，具有特异性强，高通量，高灵敏度等优点。目前，关于斑马鱼DNA甲基化酶亚型的质谱定量方法仍未出现。因此，建立一种DNMT亚型的定量方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术设计了一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型生物质谱相对定量方法，其解决的技术问题是现有技术中的斑马鱼DNA甲基化酶亚型的质谱定量方法仍未出现，也就无法可以同时测定斑马鱼的7种DNMT亚型质谱相对定量方法，其中涉及的7种DNMT分别是DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7、DNMT8。为了解决上述存在的技术问题，本专利技术采用了以下方案：一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。进一步，步骤11、将1-5mg蛋白质沉淀溶于100mmol/L碳酸氢铵和体积浓度比为5%乙腈水溶液中；步骤12、用Tris缓冲液将溶液调整为pH8.0，取少于1μL的重悬蛋白液滴于0-14的pH试纸上进行pH值的检测；步骤13、取100～200μL蛋白质样品，样品含蛋白质1mg，加入20μL浓度为25μmol/L的内参肽溶液，所用内参肽的氨基酸序列VPTPNVSVVDLTVR；步骤14、加入1/10体积的50mmol/L二硫苏糖醇DTT，60℃孵育20-40min；步骤15、加入1/10体积的100mmol/L碘乙酰胺溶液，避光，30℃孵育30min；步骤16、加入修饰过的40-80μg测序级胰蛋白酶，37℃孵育9～12小时；步骤17、用5～20μL甲酸将反应终止，得到蛋白样品反应液；步骤18、将样品载入经过1ml甲醇、1ml含有0.5%甲酸（v/v）的去离子水活化的SPE小柱上（HLB,60mg），待样品快流干前再加入3ml淋洗液（去离子水/甲醇，95:5，v/v），然后用1ml含有0.5%甲酸（v/v）的甲醇溶液洗脱；步骤19、样品经过真空浓缩至干的样品用1ml含有0.5%甲酸（v/v）的去离子水重新溶解。进一步，所述步骤2标准曲线制备包括以下步骤：步骤21、利用肽段稀释液（甲醇：去离子水混合液，体积比5:95）将肽段标准品溶解至1000nmol/L，得到标准肽段储备液；步骤22、配制DNMT特征肽浓度分别为10、25、50、100、250、500、1000nmol/L的标准品溶液，并且在各浓度标准品溶液中加入相同浓度50nmol/L的内参肽溶液；步骤23、分别取步骤22所得七种混合溶液10μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以肽段浓度与内参肽浓度比值为横坐标，肽段峰面积与内参肽峰面积为纵坐标，以加权W＝1/x2最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程得出标准曲线。进一步，所述步骤3蛋白样品中DNMT亚型含量测定步骤如下：取经由步骤1处理后的蛋白样品反应液10μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将目标肽段峰面积、内参肽峰面积代入步骤2所得的标准曲线，求得目标肽段与内参肽摩尔比值，此肽段是指于各种DNMT中选取的胰酶水解DNMT得到的肽段；将每种DNMT亚型选中的特征肽段相对摩尔比值取平均值，即为该种亚型DNMT的相对浓度。进一步，所述步骤2标准曲线制备及所述步骤3蛋白样品中DNMT含量测定中使用到的色谱条件为：色谱柱：SymmetryC18柱，2.1×100mm，3.5μm粒径；流动相：在30min内以200μL/min的流速按1%MeOH/0.1%FA至90.0%MeOH/0.1%FA进行线性梯度分离，然后保持90.0%MeOH/0.1%FA洗涤5min，最后在1%MeOH/0.1%FA条件下再平衡8min；进样量10μL；柱温30℃；以及，质谱条件为：API5500型三重四极杆液相色谱-串联质谱仪，SRM模式；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷雾电压4～4.5kV；毛细管温度300℃～350℃；源内气体1：气帘气压力30～40psi；气体2：辅助气压力5～10arb；各肽段离子对及其相应毛细管电压、碰撞能值及子离子碎片归属见表1；表1肽段多重反应监测设定值。进一步，所述的色谱条件中梯度洗脱：在30min内以200μL/min的流速按1%MeOH/0.1%FA至90.0%MeOH/0.1%FA进行线性梯度分离，然后保持90.0%MeOH/0.1%FA洗涤5min，最后在1%MeOH/0.1%FA条件下再平衡8min；进样量10μL；柱温30℃。进一步，所述DNM1特征肽段为IETTVPPAGLNFNR、KLGPINAWWITGFDGGEK；所述DNMT3特征肽段为VQEFFANDTGMEFEPH、QMFQQTDYLK；所述DNMT4特征肽段为TIFQAGLTAHSKPR、DQHFPVMMNGK；所述DNMT5特征肽段为YEMVHAFLENK、VQELFANNSAMQFEPHR；所述DNMT6特征肽段为DQHFPVFMNDK、GGVGWEVSLR；所述DNMT7特征肽段为HYTDVNNMGR、FGFCSKPEDSAK；所述DNMT8特征肽段为WASTGFLPSGPK、DQHYPVYMNNK。进一步，利用内参肽的高稳定性对步骤3的DNMT的定量结果进行的校正；所述内参肽为氨基酸序列为VGINNYWLAHK的肽段。进一步，样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证，所述质量控制样品按照如下步骤制备：步骤41、利用肽段稀释液（甲醇：去离子水混合液，体积比5:95）将合成特征肽段标准品溶解至1000nmol/L，得到特征肽储备液；步骤42、利用肽段稀释液（甲醇：去离子水混合液，体积比5:95）将肽段储备液分别稀释至10、50、500nmol/L；步骤43、标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。2.根据权利要求1所述斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，其特征在于：步骤11、将1-5mg蛋白质沉淀溶于100mmol/L碳酸氢铵和体积浓度比为5%乙腈水溶液中；步骤12、用Tris缓冲液将溶液调整为pH8.0，取少于1μL的重悬蛋白液滴于0-14的pH试纸上进行pH值的检测；步骤13、取100～200μL蛋白质样品，样品含蛋白质1mg，加入20μL浓度为25μmol/L的内参肽溶液，所用内参肽的氨基酸序列VPTPNVSVVDLTVR；步骤14、加入1/10体积的50mmol/L二硫苏糖醇DTT，60℃孵育20-40min；步骤15、加入1/10体积的100mmol/L碘乙酰胺溶液，避光，30℃孵育30min；步骤16、加入修饰过的40-80μg测序级胰蛋白酶，37℃孵育9～12小时；步骤17、用5～20μL甲酸将反应终止，得到蛋白样品反应液；步骤18、将样品载入经过1ml甲醇、1ml含有0.5%甲酸（v/v）的去离子水活化的SPE小柱上（HLB,60mg），待样品快流干前再加入3ml淋洗液（去离子水/甲醇，95:5，v/v），然后用1ml含有0.5%甲酸（v/v）的甲醇溶液洗脱；步骤19、样品经过真空浓缩至干的样品用1ml含有0.5%甲酸（v/v）的去离子水重新溶解。3.根据权利要求1所述斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，其特征在于：所述步骤2标准曲线制备包括以下步骤：步骤21、利用肽段稀释液（甲醇：去离子水混合液，体积比5:95）将肽段标准品溶解至1000nmol/L，得到标准肽段储备液；步骤22、配制DNMT特征肽浓度分别为10、25、50、100、250、500、1000nmol/L的标准品溶液，并且在各浓度标准品溶液中加入相同浓度50nmol/L的内参肽溶液；步骤23、分别取步骤22所得七种混合溶液10μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以肽段浓度与内参肽浓度比值为横坐标，肽段峰面积与内参肽峰面积为纵坐标，以加权W＝1/x2最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程得出标准曲线。4.根据权利要求1所述斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，其特征在于：所述步骤3蛋白样品中DNMT亚型含量测定步骤如下：取经由步骤1处理后的蛋白样品反应液10μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将目标肽段峰面积、内参肽峰面积代入步骤2所得的标准曲线，求得目标肽段与内参肽摩尔比值，此肽段是指于各种DNMT中选取的胰酶水解DNMT得到的肽段；将每种DNMT亚型选中的特征肽段相对摩尔比值取平均值，即为该种亚型DNMT的相对浓度。5.根据权利要求1所述斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，其特征在于：所述步骤2标准曲线制备及所述步骤3蛋白样品中DNMT含量测定中使用到的色谱条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡俊杰，范洪波，李衍亮，吴康铭，劳志朗，林勃机，袁美怡，朱丹，梁志辉，曾燕艳，
申请(专利权)人：东莞理工学院，
类型：发明
国别省市：广东,44