检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法技术

一种检测蛋白电荷变异体的方法。该方法包括，通过pH‑IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。利用根据本发明专利技术实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pI值(isoelectric point)为7.0～9.0的重组DNA蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。

【技术实现步骤摘要】
检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法。
技术介绍
目前，人用重组DNA蛋白制品或人用重组单克隆抗体制品大多是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，在产品的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解及各种翻译后修饰，从而导致产品的分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生。这些变体的形成可能发生在产品的整个生命周期内的任何阶段，有资料显示，仅翻译后修饰(如N-末端谷氨酸环化、C-末端赖氨酸截除、N-末端谷氨酰胺/谷氨酸环化、脱酰胺、氧化、唾液酸修饰等)的异质性即可达2.85×108。几乎所有这些翻译后修饰均可改变单抗的表面电荷分布特性，而电荷异质性对单抗的稳定性及其生物学功能发挥具有重要的影响而成为关键质量属性(CQA)，并且电荷异质性可反映其生产工艺的稳定性，所以受到生物技术产业界及监管机构密切关注。人用药物注册技术要求国际协调会ICH出台的指导原则中Q6B部分根据单抗变体对产品安全性、有效性的影响程度，将其分为产品相关物质及产品相关杂质，对产品相关物质及产品相关杂质的鉴别、质量研究及质量控制具有重要意义。在生产过程中，尤其是在生产工艺改变后，还需进一步监测电荷变体的形成原因及其对产品安全性、有效性的影响。通过改变工艺条件、制剂方法等方式来减少电荷变体，并对抗体的电荷变体进行评估，以确定是否需要作为放行标准以及将其作为产品一致性的参考标准。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够快速、准确、灵敏地检测蛋白电荷变异体的方法。需要说明的是，本申请所述的蛋白电荷变异体是指蛋白翻译后修饰(如唾液酸化)致使蛋白电荷量发生改变而形成的异构体。另外，需要说明的是，pH-IEC离子交换色谱法(pHGradientIonExchangeChromatography，pH梯度离子交换色谱法)的分离原理是，pH梯度可以改变检测物质电荷、偏离等电点的程度,从而影响带正/负电荷的分子或离子与色谱柱固定相的结合能力,使洗脱时的难易程度发生改变,从而改变了分离的选择性，最终实现各组分分离。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种检测蛋白电荷变异体的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括，通过pH-IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。利用根据本专利技术实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pI值为7.0～9.0的重组DNA的蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。根据本专利技术的实施例，所述检测蛋白电荷变异体的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、Tris和水的混合溶液，其中，所述哌嗪、咪唑和Tris的质量比为1:0.1:0.3。专利技术人在实验中发现，采用哌嗪、咪唑和Tris的质量比为1:0.1:0.3的混合溶液作为流动相，蛋白电荷变异体的出峰时间适宜。根据本专利技术的实施例，所述哌嗪的浓度为1g/L，所述咪唑的浓度为0.1g/L，所述Tris的浓度为0.3g/L。专利技术人在实验中发现，采用前述哌嗪、咪唑和Tris的浓度，变异体峰与主峰分离度好且峰形尖锐对称，可实现对蛋白变异体的准确定量。根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱SCX或强阴离子交换色谱柱SAX。专利技术人在实验中，相比于采用弱离子交换色谱柱，如弱阳离子交换色谱柱WCX，采用SCX或SAX可有效控制蛋白电荷变异体峰之间以及蛋白电荷变异体峰和主峰之间的分离度，控制未知杂峰的出峰。根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱SCX，流动相A的pH为5.5，流动相B的pH为10.5。专利技术人在实验中发现，在上述的流动相的pH下，pH梯度大，蛋白电荷变异体峰和主峰保留时间适宜，分离度良好。根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阴离子交换色谱柱SAX，流动相A的pH为10.5，流动相B的pH为5.5。专利技术人在实验中发现，在上述的流动相的pH下，pH梯度大，蛋白电荷变异体峰和主峰保留时间适宜，分离度良好。根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法的洗脱时间为45min，洗脱斜率为2.2％。专利技术人在实验中发现，在上述洗脱时间和斜率下，蛋白电荷变异体峰实现完全分离、出峰时间恰当且分辨力更优。根据本专利技术的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相A和流动相B的体积比为1:1，并且所采用的洗脱程序为：时间AB010002.5100047.5010052.50100541000601000专利技术人发现，在上述洗脱程序下(洗脱相对缓慢)，蛋白电荷变异体峰可与主峰实现完全分离，且峰形对称不产生包峰现象，便于定量分析。根据本专利技术的实施例，pH-IEC离子交换色谱法的上样浓度0.1～1.0mg/ml，上样量10ul～30ul，流速0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长280nm。专利技术人发现，在上述色谱条件下，可确保色谱柱载量适中，色谱信号强度适宜，峰形对称，可实现对蛋白电荷变异体的准确定量，同时为上游工艺部门工艺开发提供重要质控证据和技术支撑。根据本专利技术的实施例，基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量可通过如下方式进行：基于色谱图中蛋白电荷变异体峰面积在总峰面积的比值，确定蛋白电荷变异体在总蛋白中的含量，在已知待测蛋白总重量的情况下，确定蛋白电荷变异体的重量。根据本专利技术的实施例，进一步包括对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理；以及基于酶切前后所得色谱图中酸性电荷变异体峰的变化，确定待测蛋白中唾液酸酸性电荷变异体的含量。唾液酸酶具有特异性识别唾液酸修饰蛋白位点的特点，依据此对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理，进而观察酶切后电荷变异体峰相比于酶切前电荷变异体峰的变化，可特异性评估唾液酸酶酸性电荷变异体的含量。在本专利技术的第二方面，一种检测蛋白电荷变异体的方法，其特征在于，通过pH-IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得第一色谱图；对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理，通过pH-IEC离子交换色谱法对唾液酸酶酶切处理后产物进行分析，以便获得第二色谱图；以及基于所述第一色谱图和所述第二色谱图中酸性电荷变异体峰的变化，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量，所述待测蛋白电荷变异体的含量为所述待测蛋白中唾液酸酸性电荷变异体的含量，其中，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、Tris和水的混合溶液，所述哌嗪、咪唑和Tris的质量比为1:0.1:0.3，所述哌嗪的浓度为1g/L，所述咪唑的浓度为0.1g/L，所述Tris的浓度为0.3g/L。所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱SCX，流动相A的pH为5.5，流动相B的pH为10.5；或所采用的色谱柱为强阴离子交换色谱柱SAX，流动相A的pH为10.5，流动相B的pH为5.5，洗脱时间为45m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测蛋白电荷变异体的方法，其特征在于，通过pH‑IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白电荷变异体的方法，其特征在于，通过pH-IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、Tris和水的混合溶液，其中，所述哌嗪、咪唑和Tris的质量比为1:0.1:0.3。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述哌嗪的浓度为1g/L，所述咪唑的浓度为0.1g/L，所述Tris的浓度为0.3g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱SCX或强阴离子交换色谱柱SAX。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱SCX，流动相A的pH为5.5，流动相B的pH为10.5。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阴离子交换色谱柱SAX，流动相A的pH为10.5，流动相B的pH为5.5。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法的洗脱时间为45min，洗脱斜率为2.2％。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相A和流动相B的体积比为1:1，并且所采用的洗脱程序为：时间AB010002.5100047.5010052.50100541000601000任选地，所述pH-IEC离子交换色谱法的上样浓度0.1～1.0mg/ml，上样量10ul～30ul，流速0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长280nm。9.根据权利求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理；以及基于酶切前后所得色谱图中酸性电荷变异体峰的变化，确定待测蛋白中唾液酸酸性电荷变异体的含量。10.一种检测蛋白电荷变异体的方法，其特征在于，通过pH-IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：周昌茂，马铮，黄璐，董思聪，
申请(专利权)人：湖北生物医药产业技术研究院有限公司，人福医药集团股份公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42