一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法技术

本发明专利技术属于组织修复及其再生的生物领域，具体涉及一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。依次经过Tris‑Hcl溶液孵化、胰蛋白酶溶液作用、含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液孵化、含有乙二胺四乙酸及蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液清洗、含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液孵化、酶解、PBS缓冲液清洗。通过本发明专利技术的脱细胞方法对骨材料进行脱细胞处理后，DNA几乎没有残留，而胶原纤维可以获得保留，这样的脱细胞骨材料保留了天然材料的细胞外基质，具有良好的细胞外微环境，生物相容性好。猪骨在解剖、生理、代谢和生物活性分子上都和人有极大的相似处，更适合作为骨组织工程材料。

A method of decellularized bone material and preparation of acellular bone meal

The invention belongs to the biological field of tissue repair and regeneration, in particular to a method for decellularized bone material and a method for preparing acellular bone meal. In turn, the incubation of Tris Hcl solution, the action of trypsin solution, the incubation of Tris Hcl solution containing twelve alkyl sodium sulfate, the PBS buffer containing ethylenediamine tetra acetic acid and protease inhibitors, the Tris incubation Hcl solution containing sodium alkyl sulfate, the incubation of the Hcl solution, the enzymolysis and the PBS buffer cleaning. After decellular removal of the bone material by the method of cell removal, DNA has almost no residue, and the collagen fiber can be retained. Such acellular bone materials retain the extracellular matrix of natural materials, have good extracellular microenvironment, and have good biocompatibility. Pig bones are very similar to human beings in anatomy, physiology, metabolism and bioactive molecules. They are more suitable for bone tissue engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法
本专利技术属于组织修复及其再生的生物领域，具体涉及一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。
技术介绍
骨修复一直是临床上的难题，目前治疗骨缺损的方法以自体和异体骨组织为主。临床上自体骨移植存在取材难度大、创伤大等困难。异体骨修复存在抗原性强、免疫反应强、供体来源不足、操作复杂、周期长等问题。以脱细胞骨粉与生物可降解高分子材料为原料，可制备复合材料支架用于骨修复。细胞外基质含有正常组织所需的生长因子，从而实现组织的再生。现有方法制备的脱细胞骨粉存在免疫反应的风险。因此，需要提供一种新的方案来解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。本专利技术所采取的技术方案如下：一种骨材料脱细胞的方法，具体包括以下步骤：（1）将骨粉放入Tris-Hcl溶液中孵化20-30h，40-50℃；（2）在浓度为0.2-0.3%的胰蛋白酶溶液中，恒温35-40℃，作用20-30小时；（3）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；（4）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（5）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；（6）在浓度为30-70mM的Tris-Hclph7.3-7.7溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，恒温35-40℃，作用2-4小时；（7）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（8）用含有过氧乙酸的PBS缓冲液中，室温清洗2-4小时；（9）PBS缓冲液清洗。步骤（1）、（3）、（5）中，所用的Tris-Hcl溶液为9-11mMPH7.8-8.2。步骤（3）、（4）、（5）、（7）、（8）中，十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、过氧乙酸的浓度为0.08-0.12%。步骤（4）、（7）中，在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次25-35分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml±10%aprotinin、1ug/mL±10%leupeptin、1mM±10%PMSF。通过蛋白酶抑制剂的优化选择配合，更有利于骨中蛋白质的留存。步骤（6）中，所述氯化镁浓度为10mM±10%，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml±10%，DNA酶浓度为50U/ml±10%，RNA酶浓度为1U/ml±10%。步骤（9）中，PBS缓冲液清洗2次，每次30分钟，最后用PBS缓冲液40-50℃清洗24小时。一种制备脱细胞骨粉的方法，包括以下步骤：一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗；二、冻干、冷冻研磨成骨粉；三、采用上述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；四、后处理为成品。步骤二中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。通过这样设置的冻干研磨更有利于骨中蛋白质的留存。另一种制备脱细胞骨粉的方法，包括以下步骤：一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗，处理为0-1.5cm*0-1.5cm*0-1.5cm的块状骨；二、采用上述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；三、冻干、冷冻研磨成骨粉；四、后处理为成品。步骤三中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。通过这样设置的冻干研磨更有利于骨中蛋白质的留存。本专利技术的有益效果如下：1.通过本专利技术的脱细胞方法对骨材料进行脱细胞处理后，DNA几乎没有残留，而胶原纤维可以获得保留，这样的脱细胞骨材料保留了天然材料的细胞外基质，具有良好的细胞外微环境，生物相容性好。2.猪骨在解剖、生理、代谢和生物活性分子上都和人有极大的相似处，更适合作为骨组织工程材料。附图说明图1是本专利技术脱细胞骨粉的SEM图；图2是未脱细胞猪肋骨（a）和脱细胞猪肋骨（b）横切面的HE染色图；图3是未脱细胞猪肋骨（a）和脱细胞猪肋骨（b）纵切面的HE染色图；图4是本专利技术脱细胞骨粉DNA定量检测图；图5是未脱细胞猪肋骨和脱细胞猪肋骨Masson三色染图。具体实施方式下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本专利技术。实施例一：1．制备骨粉：取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗。将块状猪肋骨放入冷冻干燥机冻干5小时，再用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为25转每秒，时间为20分钟。2．制备脱细胞骨粉：脱细胞步骤如下：步骤一：骨粉在浓度为10mM的Tris-Hclph8.0溶液中孵化24h，恒温45℃；步骤二：在浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液中，恒温37℃，作用24小时；步骤三：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mMPH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；步骤四：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/mlaprotinin、1ug/mLleupeptin、1mMPMSF；步骤五：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mMPH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；步骤六：在浓度为50mM的Tris-Hclph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶。所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1U/ml，恒温37℃，作用3小时；步骤七：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/mlaprotinin、1ug/mLleupeptin、1mMPMSF；步骤八：用含有0.1%过氧乙酸的PBS室温清洗3小时；步骤九：PBS清洗2次，每次30分钟，最后PBS45℃清洗24小时。骨粉与脱细胞溶液的体积比为1:8；步骤一、二、三、四、五、六、七中，应置于四维旋转混合仪中脱细胞。采用冷冻干燥的方式进行后处理，得到脱细胞骨粉。3．脱细胞骨粉的抗原成分定量检测对脱细胞骨粉进行DNA定量检测，检测结果如图4所示，脱细胞骨粉DNA定量检测几乎不含有DNA成分，去除率超过97%。4．采用冷冻干燥的方式进行后处理，得到脱细胞骨粉，封装备用。实施例二：1．制备脱细胞骨：取材：取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗，制备1*0.5*0.5cm的块状骨；脱细胞步骤如下：步骤一：在浓度为10mM的Tris-Hclph8.0溶液中孵化24h，恒温45℃；步骤二：在浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液中，恒温37℃，作用24小时；步骤三：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mMPH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；步骤四：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/mlaprotinin、1ug/mLleupeptin、1mMPMSF；步骤五：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mMPH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；步骤六：在浓度为50mM的Tris-Hclph7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨材料脱细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）将骨粉放入Tris‑Hcl溶液中孵化20‑30h， 40‑50℃；（2）在浓度为0.2‑0.3%的胰蛋白酶溶液中，恒温35‑40℃，作用20‑30小时；（3）在含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液中，恒温40‑50℃，孵化20‑30小时；（4）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（5）在含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液中，恒温40‑50℃，孵化20‑30小时；（6）在浓度为30‑70mM的Tris‑Hcl ph7.3‑7.7溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，恒温35‑40℃，作用2‑4小时；（7）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（8）用含有过氧乙酸的PBS缓冲液中，室温清洗2‑4小时；（9）PBS缓冲液清洗。

【技术特征摘要】
1.一种骨材料脱细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）将骨粉放入Tris-Hcl溶液中孵化20-30h，40-50℃；（2）在浓度为0.2-0.3%的胰蛋白酶溶液中，恒温35-40℃，作用20-30小时；（3）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；（4）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（5）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；（6）在浓度为30-70mM的Tris-Hclph7.3-7.7溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，恒温35-40℃，作用2-4小时；（7）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；（8）用含有过氧乙酸的PBS缓冲液中，室温清洗2-4小时；（9）PBS缓冲液清洗。2.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（1）、（3）、（5）中，所用的Tris-Hcl溶液为9-11mMPH7.8-8.2。3.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）、（5）、（7）、（8）中，十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、过氧乙酸的浓度为0.08-0.12%。4.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（4）、（7）中，在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次25-35分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml±10%aprotinin、1ug/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李花琼，王莹莹，潘琼希，赵子建，
申请(专利权)人：温州优墨生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33