一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于拉曼光谱‑重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法。针对传统药敏检测需时长的缺点，该发明专利技术利用抗生素作用下耐药菌和敏感菌活性不同，从而C‑D拉曼峰强度不同的原理，实现了0.5至1小时内的药敏性快速检测。将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中含抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗后进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C‑D/(C‑D+C‑H)，并以处理组与对照组的比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。所述方法快速、操作和分析简便、适于不同抗生素和不同细菌，具有临床应用前景。

A rapid detection method for drug resistance of drug-resistant bacteria based on Raman spectroscopy and heavy water isotope labeling and a method for determining rational drug use

The invention discloses a rapid detection method for drug-resistant bacteria drug sensitivity based on Raman spectroscopy and heavy water isotope labeling, and a method for judging rational drug use. In view of the disadvantages of traditional drug sensitivity detection, the invention utilizes the different activity of antibiotic resistant bacteria and sensitive bacteria under the action of antibiotics, thus the rapid detection of drug sensitivity within 0.5 to 1 hours is realized by the principle of different C Raman peak intensity. The samples were incubated in the medium containing heavy water, in which the antibiotics were used as the treatment group and the antibiotics were used as the control group. The C D/ (C D+C H) of the treated group and the control group was calculated respectively after the centrifuge cleaning, and the ratio of the treatment group and the control group was taken as the criterion. Less than or equal to 0.75 is judged to be sensitive to antibiotics, more than 0.75 is judged to be resistant to the antibiotic. The method is simple, fast and convenient for operation and analysis, and is suitable for different antibiotics and different bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法
本专利技术涉及生化检测分析
，尤其涉及一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法。
技术介绍
抗生素的专利技术是医学史上最重要的进步之一，抗生素的使用有效控制了细菌感染，挽救了无数生命。医疗卫生领域占据了抗生素使用的半壁江山(另一半是养殖业)。然而，抗生素的不合理使用问题非常突出。随着抗生素的大量使用，细菌耐药问题日趋严重，导致细菌感染无法有效治愈，并在世界范围内呈现加剧的趋势，不同国家包括发达国家(英国、美国)陆续发现了可抵抗几乎所有抗生素的超级细菌，一旦感染将无药可医，严重威胁了人类健康。2011年世界卫生组织(WHO)已将细菌耐药性作为21世纪威胁人类健康的最大挑战之一。根据一个独立研究委员会的报告，如果抗生素耐药得不到有效控制，到2050年全球每年耐药感染的死亡人数可达1000万，远远超出癌症所导致的死亡数。抗生素耐药将造成全球GDP损失累计达10万亿美元。我国是世界上最大的抗生素生产和消费大国，面临的抗生素耐药问题相比世界范围更为严重。为积极应对细菌耐药带来的挑战，提高抗菌药物科学管理水平，遏制细菌耐药发展与蔓延，维护人民群众身体健康，促进经济社会协调发展，2016年8月，国家卫生计生委、发展改革委等14个部门联合印发了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》。在医学诊断上，标准的药敏检测方法是基于纯培养，即通过检测抗生素对细菌生长的最小抑制浓度(MIC)，或者抑菌圈的大小，来判断细菌的抗生素敏感性或耐药性。但是该方法非常费时，通常需要24小时甚至一周。在临床上，没有足够时间进行药敏检测，尤其对于病情严重的病例，并且一些细菌感染引起的死亡率随着时间延长快速增加。医生通常根据经验选择针对不同耐药菌的抗生素，或者直接选择广谱抗生素，即对多种细菌具有效力的抗生素。抗生素的错误使用会导致耐药病原菌富集，良性敏感菌死亡，加速病情恶化。而利用用广谱抗生素，虽一时有效，却加剧了宿主的耐药性，导致日后的无药可医。耐药菌药敏快速检测技术对抗生素的合理使用非常重要，不仅有助于快速对症(针对不同耐药菌)下药，避免抗生素错用和滥用问题，达到高效治疗效果。而且，可大大遏制抗生素耐药问题。目前，抗生素耐药菌药敏快检技术正不断涌现，包括光谱法(拉曼、红外、受激拉曼)、微流控芯片细菌显微观察法、电化学法和原子力显微镜法等。上述方法可以实现0.5至5小时内药敏性的快速检测，但距离临床使用要求还有很大距离。例如，光谱技术结合多元变量统计分析，涉及到大量数据的统计分析，分析复杂，远不如可视化便捷。受激拉曼虽然可在一定程度上可视化，但仪器昂贵复杂，不普遍。直接观察微流控芯片中细菌在抗生素作用下生长速率或分裂过程中的形态变化，来判断耐药菌，是一个可视化检测，但是对于含有多种菌的真实样品，在判断生长速度或形貌上具有局限和误差。电化学和原子力方法的检测通量太低。综述所示，目前仍然缺乏快速、操作简便、具有临床应用前景的耐药菌药敏性快速检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、简便、具有临床应用前景的基于拉曼光谱-重水同位素标记的且可快速指导合理用药的耐药菌药敏性快速检测方法。为实现上述目的,本专利技术提供一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中培养液中含有抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)值，并以处理组除以对照组的比值，即相对C-D峰强比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm-1和2800-3100cm-1。进一步，所述抗生素具有抑菌或杀菌功能。进一步，所述培养液中抗生素的浓度为5至60倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值；优选的，培养液中抗生素的浓度为10倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值。进一步，所述培养液中重水占所有水的体积百分浓度是30％至100％。进一步，所述孵育的时间为0.5至3小时；优选的，是1小时。进一步，所述离心的条件为5000rpm，3分钟；任选的，离心两次；任选的，所述清洗的清洗液为离子水或70％乙醇。进一步，所述检测的激发光波长为532、633、785nm，光栅300g/mm。本专利技术还提供一种判断合理用药的方法，其特征在于，采用前述步骤，所述培养液为含不同抗生素和重水的培养液；根据处理组的相对C-D峰强比值作为判断合理用药的标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。本专利技术在拉曼检测时引入细菌重水标记，利用敏感和耐药菌在抗生素作用下代谢活性不同，来实现耐药菌药敏性的灵敏快速检测，以及指导合理用药。具体原理是：重水中氘(D)在细菌新陈代谢活动中被摄入，用于重要生物大分子的合成，如脂质。脂质中的C-D键可被拉曼光谱灵敏检测。氘的同化量或C-D拉曼峰强度反映了细菌的代谢活性。在抗生素作用下，敏感和耐药菌代谢活性不同，敏感菌活性低或无，C-D峰弱或无；耐药菌活性高，C-D峰强，因此细菌的C-D拉曼峰可作为一个非常简单的指标，区分耐药和敏感菌，而无需借助任何谱图统计分析软件。更重要的是，细菌摄入重水半小时后，其C-D峰即可被拉曼检测，因此方法快速。另外，只需要在细菌培养液中加入重水，操作非常简便。本方法相比于传统药敏检测和其它新近发展的快速检测方法的优势和特点包括：1)与传统的基于纯培养的药敏性检测方法需时24小时至一周相比，拉曼-重水同位素标记将检测时间缩短至0.5至1小时，实现了快速区分耐药和敏感菌，并快速判断对耐药菌具有效力的抗生素，指导合理用药；2)与其它基于拉曼或红外光谱结合数据统计分析的方法比较，拉曼-重水标记方法，仅需要C-D峰这一简单指示峰，即可区分耐药和敏感菌，无需借助数据统计分析，分析更简便；3)与昂贵、不普遍、甚至需要搭建光路系统的受激拉曼光谱仪相比，拉曼-重水标记在普通共焦显微拉曼仪，或小型的便携式拉曼仪都可实现，应用前景更大；4)直接显微观察细菌分裂状态判断耐药菌的方法，对球状菌效率低。与此相比，拉曼-重水标记不受细菌形态的限制；5)操作非常简便，仅需加入重水进行1小时内的孵育；6)适用于不同作用机制的抑菌和杀菌类抗生素，适于多种抗生素；7)可进行单细胞水平或大量菌的检测，不受样品量限制。本专利技术所述拉曼-重水同位素标记方法是一个具有临床应用前景的药敏性快速检测方法，对耐药菌感染治疗、遏制细菌耐药传播、维护人民身体健康具有重要意义。附图说明图1为实施例1拉曼-重水同位素标记方法快速检测耐药菌药敏性的流程图，以及耐药菌和敏感菌的典型拉曼谱图。图2为实施例1不同孵育时间下敏感和耐药菌在无和有抗生素处理下的C-D峰强度比值结果图。图3为实施例2利用相对C-D峰强比值快速判断不同大肠杆菌的药敏性结果图。图4为实施例3利用相对C-D峰强比值快速判断不同病原菌的药敏性结果图。图5为实施例3利用传统抑菌圈方法判别药敏性结果图。具体实施方式下面详细描本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于拉曼光谱‑重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中培养液中含有抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C‑D/(C‑D+C‑H)值，并以处理组除以对照组的比值，即相对C‑D峰强比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。其中C‑D和C‑H峰分别位于2040‑2300cm‑1和2800‑3100cm‑1。

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中培养液中含有抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)值，并以处理组除以对照组的比值，即相对C-D峰强比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm-1和2800-3100cm-1。2.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述抗生素具有抑菌或杀菌功能。3.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述培养液中抗生素的浓度为5至60倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值；优选的，培养液中抗生素的浓度为10倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值。...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔丽，杨凯，朱永官，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35