快速鉴别川贝母真伪的PCR方法技术

本发明专利技术属于中药材鉴定技术领域，涉及一种快速鉴别川贝母真伪的PCR方法。具体地，本发明专利技术涉及用于鉴别川贝母真伪的引物及其在鉴别川贝母真伪中的应用。本发明专利技术进一步涉及利用所述引物快速、准确的鉴别川贝母真伪的PCR方法。

PCR method for rapid identification of the authenticity of Fritillaria

The invention belongs to the field of Chinese medicinal materials identification technology, and relates to a PCR method for quickly identifying the authenticity of Fritillaria. Specifically, the invention relates to primers for identifying the authenticity of Fritillaria and their application in identifying the authenticity of Fritillaria thunbergii. The invention further relates to the rapid and accurate identification of the true and false PCR of Fritillaria thunbergii using the primers.

【技术实现步骤摘要】
快速鉴别川贝母真伪的PCR方法
本专利技术属于中药材鉴定
，具体涉及用于鉴别川贝母真伪的引物及其在鉴别川贝母真伪中的应用；进一步涉及利用所述引物快速、准确的鉴别川贝母真伪的PCR方法。
技术介绍
中药川贝母属于百合科贝母属植物，是川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母或太白贝母的干燥鳞茎(国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015)，主产于四川及其邻近诸省(蒋舜媛、孙洪兵、秦纪洪等，基于生长适宜性和品质适宜性的川贝母功能型生产区划研究[J]，中国中药杂志，2016，41(17):3194-3201)。川贝母具有止咳化痰、降血压、增强心肌收缩力、清热、抗菌和抗病毒等作用(孙涛、彭成、谢晓芳等，川贝母止嗽颗粒对大鼠急性支气管炎的影响[J]，中药药理与临床，2013(03):150-153；孙涛、彭成，川贝母止嗽颗粒的平喘作用研究[J]，时珍国医国药，2013，24(7):1575-1577；颜晓燕、彭成，川贝母药理作用研究进展[J]，中国药房，2011，22(31):2963-2965)，被收录于历年的《中华人民共和国药典》中。在中药配方中，川贝母作为一种常规药而被广泛的应用，其中以川贝母为原料的中成药高达100种以上(中国药材公司，中国中药资源丛书，中国常用中药材[M]，科学出版社，1995)。由于川贝母的药用价值高，疗效显著，使得其市场需求量大；同时也由于川贝母的生长周期较长和过度采挖等原因，导致川贝母的野生植物资源锐减(黄璐琦，中国珍稀濒危药用植物资源调查[M]，上海科学技术出版社，2012)，进而使得川贝母的价格逐年上涨。优质川贝母每公斤的价格最高可至上万元。在经济利益驱使下，市场上以浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母混充川贝母的现象十分普遍。这严重影响了药品的安全有效性，因此川贝母的真伪鉴别意义重大。传统的川贝母鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别等方法(周亭亭，川贝母鉴定方法进展研究[J]，现代交际，2017(11):192-192)，这些鉴别方法容易受到药材生长环境、生长年限以及产地加工等诸多影响，在川贝母鉴别上存在一定的局限性(徐传林，李会军，李萍等，川贝母药材分子鉴定方法研究[J].中国药科大学学报，2010，41(03):226-230；陈士林、姚辉、韩建萍等，中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J]，中国中药杂志，2013，38(2):141-148)。例如，研究发现栽培的川贝母和暗紫贝母不含贝母素乙(王琳玲，王玲玲，于国强等，川贝母的HPLC指纹图谱研究[J]，华西药学杂志，2016，31(05):497-501)。而中国药典规定：川贝母在薄层鉴别反应中，应出现贝母素乙斑点(国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015)。这就会出现薄层鉴别法将栽培的川贝母和暗紫贝母鉴定为伪品的情况。为了提高中药材鉴别的准确性，DNA鉴别逐渐被广泛使用(辛天怡、李西文、姚辉等，中药材二维DNA条形码流通监管体系研究[J]，中国科学：生命科学，2015，45(7):695-702)。其中川贝母鉴别中最常用且最准确的DNA鉴别方法是聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP法)(胡伟、陈伟盛、林秀旎、侯惠婵，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定川贝母药材的方法优化[J]，药物分析杂志，2017，37(09):1716-1720)，该法也被中国药典2015年版收录。PCR-RFLP法首先需要进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后将PCR扩增产物进行酶切，酶切时间2～3小时不等。中国药典规定川贝母鉴别取样时以单个贝母为单位，每次取6～10粒，进行6～10次独立实验。这样在利用PCR-RFLP法进行川贝母鉴别时，由于存在酶切步骤，工作量较大，实验时间较长且成本较高，阻碍了川贝母分子鉴定的大规模推广。
技术实现思路
本专利技术利用川贝母ITS1区序列的特点(徐传林，李会军，李萍等，川贝母药材分子鉴定方法研究[J]，中国药科大学学报，2010，41(03):226-230)，设计了一条特异性上游引物，用以鉴别真伪川贝母。该引物以川贝母ITS1区的第75位碱基“C”为3'未端，并且还在引物的3'端的第3个碱基处，引入了一个碱基错配，增加了鉴别的特异性和准确性。同时，本专利技术设计了相应的下游引物，配合上游引物进行PCR扩增。使用本专利技术所述的引物，只需PCR扩增而无须进行酶切反应即可鉴别川贝母真伪，极大减少了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，并且准确度高，从而能更好的推广川贝母的分子鉴定。一方面，本专利技术提供了用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'。在一些实施例中，本专利技术所述的用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物还包含如下序列：下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'，或者下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC3'。在一些实施例中，本专利技术所述的用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'，即，引物1；或者上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC3'，即，引物2。另一方面，本专利技术提供了一种用于鉴别川贝母真伪的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含本专利技术所述的引物(即，引物1或引物2)。在一些实施例中，本专利技术所述PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系为：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。一方面，本专利技术提供了一种鉴别川贝母真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)川贝母样品基因组DNA的提取；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：引物1：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'；或者，引物2：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC3'；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在一些实施例中，本专利技术所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(2)中PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。在一些实施例中，本专利技术所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性2min；扩增30个循环，每个循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包含如下序列：下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'；或者下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC3'。3.用于鉴别川贝母真伪的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含权利要求1或2所述的引物。4.根据权利要求3所述的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系为：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。5.一种鉴别川贝母真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)川贝母样品基因组DNA的提取；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：引物1：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'；或者引物2：上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC3'；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(2)中PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亭，陆定艳，杨友辉，宋菲，薛维娜，李勇军，何彬，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52