一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白及其制备方法和应用，包括重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白的表达载体、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白的制备方法、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白在体外诊断I型过敏症方面的应用；本发明专利技术还提供了检测过敏原特异性IgE抗体的试剂盒以及检测方法。本发明专利技术的重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白其蛋白结构、理化特征更接近天然过敏原蛋白，因此检测灵敏度高，非特异性少；绝对避免传统标记批间差，简化了标记物的生产过程；简化了关键原料的制备过程，降低了生产成本，提高了过敏原的活性，节省了试剂盒使用的操作步骤和时间。

Recombinant fusion alkaline phosphatase allergens protein and preparation method and application thereof

The present invention provides a recombinant fusion alkaline phosphatase allergen protein and its preparation method and application, including the expression vector of recombinant fusion alkaline phosphatase, the preparation method of recombinant fusion alkaline phosphatase allergen protein, the recombinant fusion alkaline phosphatase allergen allergen protein, the recombinant fusion alkalinity. The application of phosphatase (phosphatase) allergen protein in the diagnosis of type I allergy in vitro; the invention also provides a kit for detecting the specific IgE antibody of allergens and the detection method. The protein structure and physicochemical characteristics of the recombinant fusion alkaline phosphatase are closer to the natural allergens, so the detection sensitivity is high and the non specificity is less, and the production process of the markers is simplified, the production process of the key raw materials is simplified and the production cost is reduced. It improves the activity of allergens and saves the operation steps and time of the kit.

【技术实现步骤摘要】
一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及体外免疫诊断
，具体涉及一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用，特别是涉及重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在IgE体外检测试剂盒方面的应用。
技术介绍
过敏症多为IgE介导的对自然界中抗原分子产生的不良免疫反应。正常情况下，血液中检测不到对一种过敏原具有特异性的IgE，仅在人体被外界抗原物质致敏后产生。引起过敏反应的物质过敏原可诱导产生一种特异性的IgE，其只与该物质发生反应。sIgE(specificIgE，特异性IgE)与过敏原结合后引起细胞释放组胺，组胺引发过敏症，如哮喘、湿疹、皮疹、眼部发痒、鼻炎、流涕等，严重者甚至昏迷、休克。传统的过敏原体内诊断试验通常具有较高的特异性和敏感性，但易受抗过敏药物和皮肤状况等影响，同时操作程序易诱发严重过敏反应，且需丰富经验的专业医生诊断，因此安全性不高。体外诊断测血清sIgE，具有安全可靠的优点，是临床常用的IgE介导的I型变态反应性疾病特异性诊断方法，具有重要的临床意义。真正意义上根据实际检测数据进行过敏原分级的检测方法只有酶联免疫荧光法和酶联免疫捕获法。酶联免疫捕获法检测总IgE和sIgE结果符合性良好，对过敏性疾病具有良好的诊断价值，操作过程中依靠酶标仪就能得到可靠的结果，而且成本适中，性价比高，有效减轻了患者的经济负担。过敏原体外诊断的传统方法，酶联免疫法如ALLERgen系统，其原理如下：抗人IgE包被酶标板，吸附样品中总IgE和特异性IgE，再与标记的过敏原形成抗体抗原复合物，最后经酶与底物显色以检测样品中IgE的含量。首先，加入样品孵育使酶标板结合所有的IgE抗体，然后洗涤，避免其他免疫球蛋白如IgG抗体的干扰，再加入生物素标记的过敏原使其与IgE特异性结合，洗涤除去未结合生物素抗原，然后加入标记了辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的链霉亲和素标记结合物，洗涤除去未结合标记结合物，加入显色底物，通过酶与底物反应后吸光度或者发光强度的变化来检测针对特异性过敏原的IgE的量。现有试剂盒的标记抗原主要是过敏原的天然提取物或重组蛋白。由于提取物纯度不足，时有蛋白酶残留，造成提取物不稳定，其中含有的杂蛋白会造成假阳性。重组过敏原成分单一浓度高，有利于提高过敏原检测的灵敏度。重组过敏原相对于天然提取物就其生产方式而言更利于进行标准化，且在不同的生产批次之间的差别更小、更稳定。重组过敏原的表达方式主要分为原核表达、酵母表达、昆虫细胞、哺乳细胞表达、植物细胞表达，原核表达产量高，但无法对重组蛋白进行一些必要的修饰，且表达产物若是包涵体，则蛋白难以复性。利用真核细胞表达过敏原，蛋白质能正确折叠，可提供复杂又准确的糖基化修饰功能，因此表达产物在分子结构、理化性质及生物学功能方面最接近于天然的高等蛋白质分子，但是相对来说，表达产量低，纯化困难，蛋白浓度较高才能够进行生物素化标记，标记之后还需要纯化，除去未标记物等，总的来说操作复杂、成本较高。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用，特别是涉及重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在IgE体外检测试剂盒方面的应用。本专利技术提供的方法能克服现有技术缺点，实现生产简单、成本低和高灵敏度。本专利技术提供了一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白的表达载体，该载体由一种含表达所述碱性磷酸酶的控制序列和表达所述过敏原蛋白的DNA分子有功能地连接组成，所述表达所述碱性磷酸酶的控制序列为pcmv-signalpeptide-seap-linker-MCS-HA或pcmv-signalpeptide-MCS-linker-seap-HA，所述linker为1-250个氨基酸。优选的，上述载体中所述过敏原蛋白包括虾原肌球蛋白、蟹原肌球蛋白、蟹精氨酸激酶、鸡蛋卵类黏蛋白Gald1、鸡蛋卵清蛋白Gald2、鸡蛋卵转铁蛋白Gald3、鸡蛋溶菌酶Gald4；牛奶β-乳球蛋白、牛奶α-乳白蛋白、牛奶酪蛋白；德国蟑螂Blag1～8、屋尘螨Derp1～2；粉尘螨Derf1～2；猫毛Feld1、狗毛Canf1或豚草中的致敏蛋白，或与所述过敏原蛋白共享抗体表位的变体或片段；所述过敏原的基因通过RT-PCR扩增获得或通过人工合成获得。优选的，上述表达载体为真核表达载体、原核表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体或植物表达载体。本专利技术的第二个目的是提供一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)将上述的表达载体转染宿主细胞进行表达；(2)筛选并建立稳定细胞系；(3)摇瓶发酵大量表达目的蛋白。优选的，所述宿主细胞为哺乳细胞、昆虫表达系统、酵母表达系统、植物表达系统；优选的，所述哺乳细胞为CHO或HEK293。本专利技术还提供了上述方法获得的重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白。本专利技术的第四个目的是提供上述重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在体外诊断I型过敏症方面的应用。本专利技术的第五个目的是提供一种检测过敏原特异性IgE抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：已包被抗人IgE的酶标板、上述重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白、样品稀释液和底物显色液；所述样品稀释液为10mmol/LpH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中含质量百分比为1％的BSA和体积百分比为0.05％的Tween-20；所述底物显色液为碱性磷酸酶化学发光液或者BCIP/NBT。本专利技术的第六个目的是提供一种检测过敏原特异性IgE抗体的方法，包含以下步骤：(1)捕获板的制备：将抗人IgE包被于96孔板上；(2)加入待测样品，所述待测样品与所述步骤(1)中的抗人IgE进行孵育，得到抗抗体与抗体的结合物；(3)将上述重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白同所述步骤(2)中的待测样品中的目的抗体进行抗原抗体反应，形成碱性磷酸酶-抗原-抗体复合物；(4)显色检测。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术涉及重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在哺乳细胞中的融合表达，利用哺乳细胞获得重组过敏原，其蛋白结构、理化特征更接近天然过敏原蛋白，因此提高了检测灵敏度，减少了非特异性反应。(2)利用分泌表达方式，表达产物碱性磷酸酶-过敏原蛋白分泌到细胞外，辅以无血清培养基，直接获得标记抗原，从而省去了传统过敏原的纯化、浓缩、标记、再纯化等过程，并且轻松实现了酶与抗原1:1的标记，绝对避免传统标记批间差，简化了标记物的生产过程。(3)利用与碱性磷酸酶融合表达的过敏原制备试剂盒，免去了过敏原纯化、浓缩、过敏原-酶标记及标记后的纯化过程，极大地简化了关键原料的制备过程，降低了生产成本，提高了过敏原的活性，节省了试剂盒使用的操作步骤和时间。(4)本专利技术的检测过敏原特异性IgE抗体的方法测血清中过敏原特异性sIgE的捕获夹心法灵敏度高、特异性强，操作简便快捷。具体实验操作步骤，将“加入生物素标记的过敏原蛋白使其与IgE特异性结合，洗涤除去未结合生物素抗原，然后加入标记了辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的链霉亲和素标记结合物”两步反应变为“加入碱性磷酸酶-过敏原蛋白”一步反应，简化了实验操作步骤，缩短了整个试剂盒的操作时间，方便用户及早获得检测结果。附图说明图1为pCMV-signalpeptide-seap-linker-MCS-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白的表达载体，所述表达载体由一种含表达所述碱性磷酸酶的序列和表达所述过敏原蛋白的DNA分子有功能地连接组成，其特征在于，所述表达所述碱性磷酸酶的控制序列为pcmv‑signal peptide‑seap‑linker‑MCS‑HA或pcmv‑signal peptide‑MCS‑linker‑seap‑HA，所述linker为1‑250个氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白的表达载体，所述表达载体由一种含表达所述碱性磷酸酶的序列和表达所述过敏原蛋白的DNA分子有功能地连接组成，其特征在于，所述表达所述碱性磷酸酶的控制序列为pcmv-signalpeptide-seap-linker-MCS-HA或pcmv-signalpeptide-MCS-linker-seap-HA，所述linker为1-250个氨基酸。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述过敏原蛋白包括虾原肌球蛋白、蟹原肌球蛋白、蟹精氨酸激酶、鸡蛋卵类黏蛋白Gald1、鸡蛋卵清蛋白Gald2、鸡蛋卵转铁蛋白Gald3、鸡蛋溶菌酶Gald4；牛奶β-乳球蛋白、牛奶α-乳白蛋白、牛奶酪蛋白；德国蟑螂Blag1～8、屋尘螨Derp1～2；粉尘螨Derf1～2；猫毛Feld1、狗毛Canf1或豚草中的致敏蛋白，或与所述过敏原蛋白共享抗体表位的变体或片段；所述过敏原的基因通过RT-PCR扩增获得或通过人工合成获得。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体、原核表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体或植物表达载体。4.一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1-3之一所述的表达载体转染宿主细胞进行表达；(2)筛选并建...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宝清，罗文婷，李晨阳，李小锋，李园枚，吴慧洁，郑佩燕，黄惠敏，韦妮莉，黄金玲，
申请(专利权)人：广州呼吸疾病研究所，广州医科大学附属第一医院，广东和信健康科技有限公司，广州锐达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44