代谢组学方法对二噁英类化合物的毒性作用进行评估技术

利用代谢组学技术对二噁英类化合物的毒性作用进行评估的方法,其特征在于：a)相同毒性当量的二噁英类化合物对人肝癌细胞进行短期暴露处理；b)提取细胞内的代谢组分进行定性、定量分析；c)利用统计分析、代谢路径分析对相同毒性当量的不同种类二噁英类化合物的毒性作用进行评估。利用该发明专利技术方法评估相同毒性当量的二噁英类化合物的对人肝癌细胞的毒性作用，结果表明，不同种类的二噁英类化合物即使毒性当量相同，不同种类的二噁英对细胞的代谢毒性作用表现出了显著的差异，而且这些差异性跟二噁英的氯代程度及氯代位置都具有显著的相关性。

【技术实现步骤摘要】
代谢组学方法对二噁英类化合物的毒性作用进行评估
本专利技术是污染物毒性评价及评估的方法，具体地说是通过相同毒性当量的不同种类的二噁英短期处理人肝癌细胞，通过对代谢组分的检测分析及后续的数据处理、代谢路径分析，对二噁英类化合物进行毒性评估。该方法通过细胞内代谢物的代谢响应及干扰的代谢路径定位，对污染物的毒性作用进行评估，是二噁英毒性作用评价的一种新方式。
技术介绍
二噁英是一类严重威胁人类健康和生态环境的持久性有机污染物。它们遍布于世界上包括空气、土壤、水、沉淀物和食物(尤其是奶制品、肉类和水生有壳动物)在内的所有媒介中[M.Lorber,P.Pinsky,P.Gehring,C.Braverman,D.Winters,W.Sovocool,Relationshipsbetweendioxinsinsoil,air,ash,andemissionsfromamunicipalsolidwasteincineratoremittinglargeamountsofdioxins,Chemosphere,37(1998)2173-2197]，由于其高稳定性、长距离迁移性及脂溶性等特点，在生物放大作用的影响下，造成人类和动物食物源的严重污染，并能够引起人体及动物的多种毒性反应[林海鹏,于云江,李琴,王丽丽,王先良,车飞,二噁英的毒性及其对人体健康影响的研究进展,环境科学与技术,32(2009)]。尤其是近年来，二噁英污染及中毒事件频频发生，极大的推动了二噁英毒理学研究的发展，研究二噁英的毒性作用并进一步探讨其毒性机制对于其生态和人类健康风险评价具有重要意义[杨永滨,郑明辉,刘征涛,二恶英类毒理学研究新进展,生态毒理学报,1(2006)105-115]。代谢组学是近几年发展起来的对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定和定量分析的一门新学科，其在毒理学中的运用正日益成为研究的热点[刘.鹏,朴丰源,王艳艳,洪.岩,代谢组学技术及其在毒理学中的应用,大连医科大学学报,30(2008)565-569]。利用小分子代谢物的变化情况来评价环境污染物的毒性作用成为环境毒理学发展的新方向[A.Kortenkamp,TenYearsofMixingCocktails:AReviewofCombinationEffectsofEndocrine-DisruptingChemicals,EnvironHealthPersp,115(2007)98-105]。到目前为止,细胞尤其是人体细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。和体内模型不同的是,细胞模型更适合小型化和高通量有毒物质筛选平台的使用,提供广泛的、全面的研究毒性的方法。人体细胞作为一种体外毒性评价工具，具有快速、敏感、特异高、条件易控等优点，可以避免使用大批动物进行的长时间毒理研究，不仅可以节省动物及人力投入，还可缩短实验周期，增加实验的敏感性，是目前为止较为理想的毒性分析工具[E.V.Hestermann,J.J.Stegeman,M.E.Hahn,Serumalterstheuptakeandrelativepotenciesofhalogenatedaromatichydrocarbonsincellculturebioassays,Toxicol.Sci.,53(2000)316-325]。不少研究表明，二噁英可以引发生物体内葡萄糖、氨基酸及尿素等代谢的紊乱[C.Lu,Y.Wang,Z.Sheng,G.Liu,Z.Fu,J.Zhao,X.Yan,B.Zhu,S.Peng,NMR-basedmetabonomicanalysisofthehepatotoxicityinducedbycombinedexposuretoPCBsandTCDDinrats,ToxicolApplPharmacol,248(2010)178-184]，如对2,3,7,8-TCDD的系统研究表明，2,3,7,8-TCDD可以干扰细胞内多种小分子代谢物，且有的代谢物表现出显著的剂量-效应关系[张保琴,张海军,陈吉平,杨常青,2,3,7,8-TCDD的短期暴露对HepG2肝癌细胞内小分子代谢产物的影响,生态毒理学报,7(2012)292-298.]，因此用小分子代谢物的变化来反馈二噁英的毒性作用是完全可行的，[E.V.Hestermann,J.J.Stegeman,M.E.Hahn,Serumalterstheuptakeandrelativepotenciesofhalogenatedaromatichydrocarbonsincellculturebioassays,Toxicol.Sci.,53(2000)316-325]。基于此，本专利用相同毒性当量的不同种类二噁英短期处理人肝癌细胞，通过对代谢组分的检测分析及后续的数据处理、代谢路径分析，灵敏准确地定位不同种类二噁英的毒性效应。并比较异同点，对不同种类的二噁英类化合物进行毒性评估。
技术实现思路
本专利技术的目的在于发展一种对二噁英类化合物进行快速、高效、准确的毒性评估方法。传统的二噁英类化合物毒性评价是是利用毒性当量因子计算，通过计算二噁英的毒性当量进行毒性评价。另一方面，毒性的评估基于动物实验，评价周期长，且人与动物的亲缘关系比较远，人体细胞在毒理学中的应用越来越广泛，且敏感性高，相对于传统的毒性评价参数，代谢组学指标作为代谢的终点，更能灵敏的指示毒性作用的程度，因此，本专利技术所采用的技术方案是：选择相同毒性当量的不同种类的二噁英，对人体细胞进行短期的暴露处理，通过质谱检测细胞内代谢物的种类和含量变化，数据统计和代谢路径分析评估二噁英的毒性作用。a)选择的人体细胞为人肝癌细胞，暴露时间为24h；b)代谢物检测分析仪器为UPLC-QTRAP，检测模式为SRM；c)数据处理采用的是显著性分析、主成分分析、热重分析，代谢路径分析采用的是http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml中的路径分析程序。此方法涉及到的人体肝癌细胞为HepG2细胞，此细胞是污染物毒性评价的常用细胞，且在二噁英的毒性评价中较为常用。步骤a选择的二噁英为2,3,7,8位取代的PCDD和PCDF共计17种；步骤b中的代谢物分别包括了细胞极性成分和非极性成分两部分；步骤b中UPLC-QTRAP检测分析方法色谱条件选择C8柱和C18柱，质谱条件分别选择ESI正负离子模式，SRM检测；步骤a中，选择的二噁英类的污染物的暴露浓度为1nMTEQ；步骤a中选择的细胞培养液为DMEM培养液；步骤b中极性代谢物和非极性代谢物全部提取检测；步骤c中对二噁英类污染物进行评估的依据是代谢物的显著性变化程度和干扰的代谢路径的定位。本专利技术具有如下优点：(1)利用人体细胞作为暴露模型，即解决了种属差异的问题，又能缩短分析时间；(2)代谢组学参数更能灵敏的指示污染物的毒性效应；(3)不同毒性作用模式的差别方便对相同种类的不同二噁英类化合物进行毒性评估；利用该专利技术方法对二噁英类化合物的毒性作用进行评估，人体细胞敏感度高，暴露时间短，可大规模的进行对照及平行处理，代谢组学指标作为代谢的终点更能灵敏的指示二噁英类污染物的毒性作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二噁英类化合物毒性作用评估的方法,其特征在于：利用代谢组学技术对二噁英类化合物的毒性作用进行评估的操作步骤如下：a)相同毒性当量的不同种类二噁英类化合物对人肝癌细胞进行暴露处理；b)提取细胞内的代谢组分进行定性、定量分析；c)利用统计分析、代谢路径分析对相同毒性当量的不同种类二噁英类化合物的毒性作用进行评估。

【技术特征摘要】
1.一种二噁英类化合物毒性作用评估的方法,其特征在于：利用代谢组学技术对二噁英类化合物的毒性作用进行评估的操作步骤如下：a)相同毒性当量的不同种类二噁英类化合物对人肝癌细胞进行暴露处理；b)提取细胞内的代谢组分进行定性、定量分析；c)利用统计分析、代谢路径分析对相同毒性当量的不同种类二噁英类化合物的毒性作用进行评估。2.按照权利要求1所述的对二噁英毒性评估方法，其特征在于：此方法涉及到的二噁英类化合物包括具有毒性当量因子的17种有毒的二噁英中的二种以上；步骤a中的人肝癌细胞为HepG2；步骤b中细胞内代谢物包括极性代谢物和非极性代谢物；步骤b中代谢物检测方法为UPLC-QTRAP；步骤c中统计学处理包括：显著性分析、主成分分析、热重评估、代谢轮廓分析中的一种或二种以上；步骤c中的代谢路径分析采用的是http://www.me...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保琴，耿柠波，张海军，陈吉平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21