一种梭子蟹蛋白粉及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种梭子蟹蛋白粉，其制备方法包括：预处理、分离、提取、纯化，首先将梭子蟹肉组织加入裂解液中研磨匀浆，离心后浓缩，加入丙酮脱脂，去除丙酮后加入PBS搅拌、离心，收集上清即得梭子蟹粗蛋白液，然后以梯度硫酸铵对梭子蟹粗蛋白液进行分段盐析，经柱层析、透析和浓缩后即得梭子蟹蛋白粉。本发明专利技术还公开了梭子蟹蛋白粉用于诊断临床梭子蟹螯过敏性疾病的应用。有益效果为：梭子蟹蛋白粉组分较完整，分子量跨度大，免疫活性强，与血清特异性免疫球蛋白结合更强，更适合应用于临床诊断梭子蟹螯过敏性疾病，而且在梭子蟹蛋白粉的制备过程可大大降低蛋白质变性，使蛋白质浓缩液经超低温冷冻后依然保存原有的蛋白活性。

A kind of protein powder of Portunus and its use

The invention discloses a protein powder of shuttle crab. The preparation method comprises the following steps: preprocessing, separation, extraction and purification. First, the tissue of the shuttle crab meat is added to the lysate to lapping homogenate, then centrifuged and concentrated, adding acetone to degrease, after removing acetone and adding PBS to agitation and centrifugation, and then collect the crude protein solution of the shuttle crab, and then get the crude protein solution of the shuttle crab. The protein powder of Portunus swimming crab was obtained by fractionation and salting out of crude protein solution by gradient ammonium sulfate. The invention also discloses the application of Portunus albumen powder to diagnose clinical allergic diseases of swimming crab. The beneficial effects are: the protein powder of the shuttle crab is more complete, the molecular weight span is large, the immune activity is strong, and the combination of the serum specific immunoglobulin is stronger. It is more suitable for the clinical diagnosis of the allergic disease of the portunus crabs, and it can greatly reduce the protein denaturation and make the protein concentration liquid in the preparation process of the protein powder of the shuttle crab. After cryopreservation, the protein activity was still preserved.

【技术实现步骤摘要】
一种梭子蟹蛋白粉及其用途
本专利技术涉及梭子蟹深加工领域，尤其是涉及一种梭子蟹蛋白粉及其用途。技术背景梭子蟹，有些地方俗称“白蟹”。因头胸甲呈梭子形，故名梭子。甲壳的中央有三个突起，所以又称“三疣梭子蟹”，属于节肢动物。雄性脐尖而光滑，螯长大，壳面带青色；雌性脐圆有绒毛，壳面呈赭色，或有斑点。梭子蟹肉肥味美，有较高的营养价值和经济价值，且适宜于海水暂养增肥。头胸甲梭形，宽几乎为长的2倍；头胸甲表面覆盖有细小的颗粒，具2条颗粒横向隆堤及3个疣状突起；额具2只锐齿；前侧缘具9只锐齿，末齿长刺状，向外突出。螯脚粗壮，长度较头胸甲宽长；长节棱柱形，雄性长节较修长，前缘具4锐棘。研究显示，存在于甲壳类动物中的过敏原有原肌球蛋白、球蛋白轻链、精氨酸激酶、肌钙蛋白C等，不同种类的甲壳类动物过敏组分不同。此外，不同个体间对同一过敏食物的反应存在异质性，可能导致漏检。因此，为提高临床诊断梭子蟹螯蟹过敏原的灵敏度和特异度及脱敏治疗的效果，需要制备组分全、免疫活性好的过敏原溶液，开发适合我国人群的过敏性疾病诊断试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种梭子蟹蛋白粉及其用途，梭子蟹蛋白粉组分较完整，分子量跨度大，免疫活性强，与血清特异性免疫球蛋白结合更强，更适合应用于临床诊断梭子蟹螯过敏性疾病，而且在梭子蟹蛋白粉的制备过程可大大降低蛋白质变性，使蛋白质浓缩液经超低温冷冻后依然保存原有的蛋白活性。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种梭子蟹蛋白粉，其制备方法包括：预处理、分离、提取、纯化，具体包括以下步骤：预处理：在液氮环境中，将梭子蟹肉组织按料液比1：6-8加入裂解液中并研磨均匀，再用电动匀浆器匀浆30-60秒，0-4℃冰箱静置1-2小时，于10000-13000r/min、0-4℃条件下离心60-90分钟，收集上清，过滤后浓缩至30-35%分装至-60～-80℃保存，备用；将梭子蟹肉组织加入裂解液中并充分研磨匀浆，可以将梭子蟹肉组织中的蛋白质与糖类、脂肪类初步分离，并将杂质剔除，为进一步的提取小黄鱼蛋白质做好准备；分离：将初步提取浓缩液解冻，按照体积比1∶12-15加入丙酮，置0-1℃冰箱脱脂24-48小时，期间换液1次，搅拌2-4小时，后滤去丙酮，干燥后称重，每克样品加15-17mlPBS，1-4℃静置48-72小时，每12小时搅拌1-2小时，然后置于1-4℃、12000-15000r/min条件下离心20-30分钟，收集上清即得梭子蟹粗蛋白液，置于-35～-40℃保存；通过丙酮脱脂，可大大降低粗蛋白液中的脂肪酸含量，同时以PBS溶解可除去浓缩液中的糖类，提高粗蛋白液中的蛋白质含量；提取：依次用30%、50%、70%、90%饱和度的硫酸铵对梭子蟹粗蛋白液进行分段盐析，具体方法为：在搅拌下缓慢加入硫酸铵，使其达到所需饱和度，再缓慢搅拌1-1.5小时，1-2℃静置2-3小时，然后置于1-4℃、12000-15000r/min条件下离心20-30分钟，收集沉淀溶于PBS，对梭子蟹粗蛋白液重复上述步骤，得到其余饱和度的硫酸铵沉淀组分；以不同梯度浓度的硫酸铵沉淀可以析出各饱和度状态下的蛋白质，不仅可以防止蛋白质的流失，还可以大大提高蛋白质的得率与纯度；纯化：DEAE-CelluloseDE-52纤维素预处理后装柱，柱尺寸为1.0cm×40.0cm，以0.01-0.015mol/LTris-HCl缓冲液充分平衡，将硫酸铵沉淀组分上样，以2倍柱床体积的相同缓冲液洗柱，再用0.1-0.5mol/LNaCl＆0.01-0.015mol/LTris-HCl溶液梯度洗脱，调节流速为1.5-2.5mL/min，在210、280nm下测定其紫外吸收，并收集各洗脱峰组分，用PBS充分透析和浓缩后即得梭子蟹蛋白粉，置于-35～-45℃保存；通过柱层析，可以得到与血清特异性免疫球蛋白结合更强、分子量跨度较大，免疫活性较强的梭子蟹蛋白质，而且蛋白质的纯度与得率较高，可以通过与血清特异性免疫球蛋白结合，应用于临床梭子蟹螯过敏性疾病的诊断，具有重要的意义。作为优选，Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。作为优选，PBS的pH为7.4。作为优选，裂解液为7-8mol/L尿素、2-3mol/L硫脲、4-5%CHAPS、40-45mmol/LTris、3-4mmol/L4-乙基苯甲酸、0.3-0.5mmol/LL-赤藓糖，余量为去离子水，使用前加入45-65mmol/LDTT；尿素和硫脲可以增加疏水蛋白的溶解性并防止蛋白之间相互作用，CHAPS促进蛋白质分散，DTT还原多肽链的二硫键，此外，特殊配比的4-乙基苯甲酸与L-赤藓糖具有协同作用，该协同作用可以增大L-赤藓糖与二硫键两端的氢原子形成的氢键数量，从而占据二硫键周边的空间，增大空间位阻，降低因冷冻引起的“浓缩效应”可能导致的蛋白质分子内、分子间二硫键的交换反应的增加，从而降低蛋白质变性，使蛋白质浓缩液经超低温冷冻后依然保存原有的蛋白活性。一种梭子蟹蛋白粉的用途，梭子蟹蛋白粉可通过与血清特异性免疫球蛋白结合，用于诊断临床梭子蟹螯过敏性疾病，所获得的梭子蟹蛋白份组分较完整，分子量跨度大，免疫活性强，与血清特异性免疫球蛋白结合更强，更适合应用于临床诊断梭子蟹螯过敏性疾病。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）特殊配比的4-乙基苯甲酸与L-赤藓糖具有协同作用，该协同作用可以增大L-赤藓糖与二硫键两端的氢原子形成的氢键数量，从而占据二硫键周边的空间，增大空间位阻，降低因冷冻引起的“浓缩效应”可能导致的蛋白质分子内、分子间二硫键的交换反应的增加，从而降低蛋白质变性，使蛋白质浓缩液经超低温冷冻后依然保存原有的蛋白活性；2）所获得的梭子蟹蛋白份组分较完整，分子量跨度大，免疫活性强，与血清特异性免疫球蛋白结合更强，更适合应用于临床诊断梭子蟹螯过敏性疾病。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种梭子蟹蛋白粉，其制备方法包括以下步骤：1）在液氮环境中，将梭子蟹肉组织按料液比1:6加入裂解液中并研磨均匀，裂解液为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、40mmol/LTris、3mmol/L4-乙基苯甲酸、0.3mmol/LL-赤藓糖，余量为去离子水，使用前加入45mmol/LDTT；再用电动匀浆器匀浆30秒，0℃冰箱静置1小时，于10000r/min、0℃条件下离心60分钟，收集上清，过滤后浓缩至30%分装至-60℃保存，备用；2）将初步提取浓缩液解冻，按照体积比1:12加入丙酮，置0℃冰箱脱脂24小时，期间换液1次，搅拌2小时，后滤去丙酮，干燥后称重，每克样品加15mlPBS，PBS的pH为7.4，1-4℃静置48小时，每12小时搅拌1小时，然后置于1℃、12000r/min条件下离心20分钟，收集上清即得梭子蟹粗蛋白液，置于-35℃保存；3）依次用30%、50%、70%、90%饱和度的硫酸铵对梭子蟹粗蛋白液进行分段盐析，具体方法为：在搅拌下缓慢加入硫酸铵，使其达到所需饱和度，再缓慢搅拌1小时，1℃静置2小时，然后置于1℃、12000r/min条件下离心20分钟，收集沉淀溶于PBS，对梭子蟹粗蛋白液重复上述步骤，得到其余饱和度的硫酸铵沉淀组分；4）DEAE-Ce本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种梭子蟹蛋白粉，其制备方法包括：预处理、分离、提取、纯化，其特征在于：所述预处理步骤为：在液氮环境中，将梭子蟹肉组织按料液比1:6‑8加入裂解液中并研磨均匀，再用电动匀浆器匀浆30‑60秒，0‑4℃冰箱静置1‑2小时，于10000‑13000r/min、0‑4℃条件下离心60‑90分钟，收集上清，过滤后浓缩至30‑35%分装至‑60～‑80℃保存，备用。

【技术特征摘要】
1.一种梭子蟹蛋白粉，其制备方法包括：预处理、分离、提取、纯化，其特征在于：所述预处理步骤为：在液氮环境中，将梭子蟹肉组织按料液比1:6-8加入裂解液中并研磨均匀，再用电动匀浆器匀浆30-60秒，0-4℃冰箱静置1-2小时，于10000-13000r/min、0-4℃条件下离心60-90分钟，收集上清，过滤后浓缩至30-35%分装至-60～-80℃保存，备用。2.根据权利要求1所述的一种梭子蟹蛋白粉，其特征在于：所述预处理步骤中，裂解液为7-8mol/L尿素、2-3mol/L硫脲、4-5%CHAPS、40-45mmol/LTris、3-4mmol/L4-乙基苯甲酸、0.3-0.5mmol/LL-赤藓糖，余量为去离子水，使用前加入45-65mmol/LDTT。3.根据权利要求1所述的一种梭子蟹蛋白粉，其特征在于：所述分离步骤为：将初步提取浓缩液解冻，按照体积比1:12-15加入丙酮，置0-1℃冰箱脱脂24-48小时，期间换液1次，搅拌2-4小时，后滤去丙酮，干燥后称重，每克样品加15-17mlPBS，1-4℃静置48-72小时，每12小时搅拌1-2小时，离心后收集上清即得梭子蟹粗蛋白液，置于-35～-40℃保存。4.根据权利要求3所述的一种梭子蟹蛋白粉，其特征在于：所述分离步骤中，离心的温度为1-4℃，转速为12000-15000r/min，离心时间为20-30分钟。5.根据权利要求1所述的一种梭子蟹蛋白粉，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶常青，谢超，
申请(专利权)人：舟山海研食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33