有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法技术

本申请公开了一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，包括以下步骤：(1)水稻总RNA的提取；(2)RT‑PCR；(3)SSSIII‑2基因片段全长CDS片段的克隆和测序；(4)OsSSSIII‑2基因的过表达载体的构建；(5)农杆菌水稻遗传转化。本发明专利技术育种方法，有效的降低了水稻直链淀粉的含量。 1

【技术实现步骤摘要】
有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法
本专利技术涉及分子生物学植物育种
，特别涉及一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法。
技术介绍
水稻是世界上栽培面积和总产量仅次于小麦的主要粮食作物之一，全球半数以上的人口都以水稻为主食，同时也是我国重要的粮食作物，种植总面积和总产量居于世界前列。直链淀粉含量(AmyloseContent，AC)是评价稻米品质的最重要的一项指标，此项指标直接影响了稻米的蒸煮品质、食用品质和加工品质。一般直链淀粉含量过高的稻米，蒸煮后米饭偏硬，干燥蓬松；直链淀粉含量低的稻米，蒸煮后米饭软，黏且腻，弹性差。如果直链淀粉含量过低的话，米饭则呈现出过软过黏的性状，口感较差，但是直链淀粉含量较高的品种一般用于制粉、制丝、酿啤等。因此最受欢迎的稻米则是直链淀粉含量适中的稻米，直链淀粉含量较低的品种一般可用于制作婴幼儿产品。根据国家优质稻米标准，一级稻米的直链淀粉含量为17％～22％。高等植物淀粉的合成是在质体中进行的，在淀粉体基质中，淀粉的形成是通过高分子量的聚合体结晶而完成的，高分子量的聚合体包括如无定形淀粉分子、蛋白质以及脂类。淀粉合成的整个过程主要由四大酶类共同协同完成，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合(成)酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶。整个完整的生物合成可分为3个途径：①ADP葡萄糖的产生；②支链淀粉的合成和淀粉粒的形成；③直链淀粉的合成。在水稻胚乳中，合成淀粉的葡萄糖来源两种途径，第一种是由叶片光合作用直接合成的蔗糖；第二种是由淀粉降解产生的蔗糖，这些葡萄糖都通过韧皮部长距离运输至胚乳细胞中。在细胞液当中，蔗糖首先在蔗糖合成酶的作用下分解，形成果糖和UDP-葡萄糖，随后将果糖通过果糖激酶，将其水解成6-磷酸果糖，然后在磷酸葡萄糖异构酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖，或者在葡萄糖磷酸变位酶的催化作用下形成1-磷酸葡萄糖同分异构体。而UDP-葡萄糖也可形成1-磷酸葡萄糖。最后将生成的1-磷酸葡萄糖通过ADP葡萄糖焦磷酸化酶的催化作用下形成ADP葡萄糖。ADP葡萄糖最后在淀粉合成酶和分支酶两者共同作用下合成淀粉。淀粉合成酶是以腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)为葡萄糖的供体，是对葡萄糖聚合体通过糖基(glycosyl)转移而催化a-1，4糖苷键的延长作用的酶。根据水溶性的不同，淀粉合成酶分为淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SSS)，前者的功能是合成直链淀粉，而后者的功能则是合成支链淀粉。颗粒结合淀粉合成酶由蜡质基因(Waxy，Wx)编码，包裹于淀粉粒中，而游离的GBSS基本丧失了淀粉合成酶的活性。GBSS有两种不同的同工型GBSSI和GBSSII。其中GBSSI广泛存在于各种植物中，只在储藏组织中表达，负责直链淀粉的合成；而GBSSII在叶片和其它非储藏组织中都有表达，负责临时淀粉的合成。利用转反义Wx基因粳稻和籼稻为研究材料，发现当Wx蛋白缺失的时候，颖果的生理活性甚至颖果储藏物质的积累最终使千粒重下降。可溶性淀粉合成酶(SSS)是一大类淀粉合成酶，可分为SSSI、SSSII、SSSIII以及SSSIV等四个亚家族。在水稻种，SSS有8个同工型，SSSI、SSSIIa、SSSIIb、SSSIIc、SSSIIIa、SSSIIIb、SSSIIIc、SSSIVa和SSSIVb。SSS主要存在于质体的基质中，同淀粉分支酶和淀粉脱分支酶一起参与支链淀粉的合成。有研究表明，水稻SSS各同工型基因对花后高温胁迫的响应表达模式明显不同，呈上调模式的基因有SSSII-2、SSSII-3、SSSIII-2以及SSSIV-1；SSSII-1和SSSIII-1呈下调表达模式。SSSI和SSSIII-1是水稻SSSs基因在胚乳中表达的主要形式，而另外6种同工型基因的相对表达量均比较低。通过对缺失某一同工型的突变体研究可以获得这些同工酶在淀粉合成中的各自作用。水稻SSSI基因在水稻胚乳发育的整个过程中都发挥着作用，它的主要功能是将支链淀粉中聚合度为6-7的链延伸至8-12。当SSSI基因缺失时，水稻淀粉颗粒形状大小以及胚乳淀粉的结晶度没有变化，说明还有其他SSS同工型可以弥补该基因缺失带来的影响[15]。SSSI在植物中表达部位有所不同，其中在胚乳中表达最高。马铃薯SSSI基因主要在叶片中表达，玉米SSSI基因也只在胚乳中表达。水稻中SSSII有三种同工型，SSSII-1、SSSII-2和SSSII-3。SSSIIa的突变体DP＜11增加，DP12-25减少，易糊化，易溶于尿素。推测SSSIIa作用是延长A和B1链。在水稻中，SSSIII-1基因主要在叶片中表达，而SSSIII-2基因主要在胚乳中表达。当SSSIII-1缺失时，淀粉DP＞30、DP6-9以及DP16-19的支链降低，DP10-15和DP2-25增加。直链淀粉含量增加，淀粉颗粒形态发生变化，长支链增加，形状变圆，结晶度也降低。因此，得出SSSIII-1的主要作用是延长B2链。当SSSIII2缺失后，稻米品质变化明显。AC含量有一定增加，其中支链淀粉B链DP≥30合成受阻，超长支链(ELC)DP≥500有所增加；DP6-9和DP16-19减少，而DP10-15和DP20-25间有所增加。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，包括以下步骤：(1)水稻总RNA的提取；(2)RT-PCR；(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序；(4)OsSSSIII-2基因的过表达载体的构建；(5)农杆菌水稻遗传转化。所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，可以进一步包括：(1)水稻总RNA的提取：剪取新鲜的水稻叶片组织0.5-1g，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状后，利用天根总RNA提取试剂盒对叶片的总RNA进行提取。所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，还可以进一步包括：(2)RT-PCR：从所提取的水稻总RNA中取400-600ng的RNA进行反转录，反转录步骤按照TaKaRa的PrimeScriptRTreagentKit(PrefectRealTime)试剂盒提供的操作规程与试剂进行；PCR结束后，将所得的产物保存于-20℃冰箱备用。所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，也可以进一步包括：(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序：SSSIII-2基因的上下游引物，结合Pbi121的载体特点，在引物5’端分别引入BamHI和SacI的酶切位点，引物序列如下：所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，可以进一步包括：(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序：以cDNA一链为模板，进行SSSIII-2全基因长的CDS扩增，PCR反应采取天根公司的PCR试剂进行扩增。所述(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序的步骤优选进一步包括：扩增产物为845bp；回收的目的基因片段连接到pMD18-T的载体上，并用热激法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落，进行菌落PCR检测。所述(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

【技术特征摘要】
1.一种有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)水稻总RNA的提取；(2)RT-PCR；(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序；(4)OsSSSIII-2基因的过表达载体的构建；(5)农杆菌水稻遗传转化。2.根据权利要求1所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，进一步包括：(1)水稻总RNA的提取：剪取新鲜的水稻叶片组织0.5-1g，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状后，利用天根总RNA提取试剂盒对叶片的总RNA进行提取。3.根据权利要求1所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，进一步包括：(2)RT-PCR：从所提取的水稻总RNA中取400-600ng的RNA进行反转录，反转录步骤按照TaKaRa的PrimeScriptRTreagentKit(PrefectRealTime)试剂盒提供的操作规程与试剂进行；PCR结束后，将所得的产物保存于-20℃冰箱备用。4.根据权利要求1所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，进一步包括：(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序：SSSIII-2基因的上下游引物，结合Pbi121的载体特点，在引物5’端分别引入BamHI和SacI的酶切位点，引物序列如下：5.根据权利要求1所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，进一步包括：(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片段的克隆和测序：以cDNA一链为模板，进行SSSIII-2全基因长的CDS扩增，PCR反应采取天根公司的PCR试剂进行扩增。6.根据权利要求5所述的有效降低水稻直链淀粉含量的育种方法，其特征在于，所述(3)SSSIII-2基因片段全长CDS片...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳音，张国栋，卞士权，徐春莹，罗碧，米铁柱，
申请(专利权)人：青岛袁米农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37