一种黄精多糖的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及中药有效成分的制备方法及其应用领域，具体涉及一种黄精多糖的制备方法及其在制备免疫增强药物中的应用。将黄精生药材经过炮制、提取分离后得到黄精多糖，采用本发明专利技术的提取方法，黄精多糖提取率高，且总多糖含量高，黄精多糖对正常小鼠脾细胞增殖活力有所提高，也可提高由环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠的脾脏与胸腺指数，增强刀豆蛋白A刺激下脾脏与胸腺细胞体外增殖能力，增强免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能和分泌IL‑6和TNF‑α的能力，在免疫缺陷病和肿瘤等疾病的治疗方面，具有实际应用价值。 1

Preparation and application of a kind of Polygonatum Polysaccharide

The invention relates to the preparation method of the effective ingredients of Chinese medicine and the application field, in particular to a preparation method of the Yellow essence polysaccharide and its application in the preparation of immune enhanced drugs. The polysaccharides of yellow semen were obtained after processing and separating, and the extraction method of this invention was used. The extraction rate of Huang Jing polysaccharide was high, and the total polysaccharide content was high. The Polygonatum Polysaccharide could increase the proliferation of spleen cells in normal mice, and also improve the spleen and thymus index of mice induced by cyclophosphamide induced immunodeficiency. Enhancing the proliferation of spleen and thymocyte in vitro stimulated by A, enhanced the phagocytosis of macrophages in immunocompromised mice and the ability to secrete IL 6 and TNF alpha, and was of practical value in the treatment of diseases such as immunodeficiency disease and tumor. One

【技术实现步骤摘要】
一种黄精多糖的制备方法及应用
本专利技术涉及中药有效成分的制备方法及其应用领域，具体涉及一种黄精多糖的制备方法及其在制备免疫增强药物中的应用。
技术介绍
黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumkingianumColl.etHemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed.或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎。性味甘平，归脾、肺、肾经，具有补气健脾之功效。黄精具有可食用、药用、观赏、美容等作用，常用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。黄精多糖是黄精的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、抗动脉粥样硬化等功能。黄精中的多糖含量普遍在10％以上，目前用于提取黄精多糖的提取分离方法包括热水提取、醇析分离、微波辅助提取、超声波提取等，但是提取的多糖纯度不高(<80％)。结合现代化学与药理研究成果，对黄精多糖类成分加以开发利用，发掘新药，将对传统中药黄精的开发与应用有现实意义。环磷酰胺作为临床上常用的抗肿瘤药物，可杀伤肿瘤细胞，同时具有明显的免疫抑制作用。大量的药理学研究表明，一些多糖类的化合物能够调节免疫，激活机体的免疫细胞，提高机体的免疫功能。本专利技术旨在探究黄精多糖对环磷酰胺诱导小鼠免疫低下的影响，为黄精多糖作为环磷酰胺的免疫佐剂提供合理的依据。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供了一种黄精多糖的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种黄精多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)将黄精生药材洗净，加水浸泡(10-20分钟)后堆积在干净的台面上4-10h，用湿布遮盖，期间喷洒清水，润至药材内无干心，然后蒸至黄黑色、柔软为度，关火继续焖至外表棕黑色、有光泽，出锅，晾至外干内润，切成(3～5)mm厚片，烘干；(2)取步骤(1)的切片，研成粉末，用80～95％(v/v)的乙醇水溶液回流提取2-3次，过滤，所得药渣烘干；(3)向步骤(2)的烘干后的药渣中加入蒸馏水于80℃回流提取2-4次，过滤，滤液浓缩至浸膏状态后，加入乙醇，至乙醇含量为70％-90％(v/v)，搅拌均匀，然后于4℃下放置(8-12)h，过滤，沉淀烘干，即得粗多糖；(4)将步骤(3)所得粗多糖用Sevage法除去蛋白；(5)将步骤(4)除去蛋白后的多糖用水溶解后，于流水中透析48h；取透析液真空冷冻干燥，得到黄精多糖。进一步的，所述步骤(1)中加水浸泡后在蒸笼中蒸4～8h，关火继续焖4～8h，出锅；优选为在蒸笼中蒸6h，关火继续焖6h，出锅。进一步的，步骤(1)中所述烘干为置于恒温烘干箱70℃烘干。进一步的，步骤(2)中所述烘干温度低于50℃。进一步的，步骤(2)中所述用80～95％(v/v)的乙醇水溶液回流提取的过程为：用95％(v/v)乙醇于60℃回流3h，过滤；然后向所得固体中加入80％(v/v)乙醇于60℃回流2h，过滤，药渣烘干；进一步的，步骤(3)中所述加入蒸馏水于80℃回流提取过程为：向步骤(2)烘干后的药渣中加入蒸馏水于80℃下回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液。进一步的，所述步骤(3)中烘干后的药渣与每次提取时蒸馏水用量比为1g：20-30mL，优选为1g：25mL。本专利技术的另一个目的是提供了一种上述方法制备的黄精多糖作为抗肿瘤药物的辅助药的应用，具体为在制备治疗由环磷酰胺诱导的免疫低下疾病的药物中的应用。本专利技术的第三个目的是提供了一种上述方法制备的黄精多糖在制备免疫增强药物中的应用。实验表明黄精多糖对正常小鼠脾细胞增殖活力有所提高，也可提高由环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠的脾脏与胸腺指数，增强刀豆蛋白A刺激下脾脏与胸腺细胞体外增殖能力，增强免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能和分泌IL-6和TNF-α的能力，在免疫缺陷病和肿瘤等疾病的治疗方面具有实际应用价值。附图说明图1为黄精多糖对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响图，与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。图2为黄精多糖对正常小鼠脾细胞体外增殖活力的影响图，与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。具体实施方式下面申请人将结合具体的实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细说明。实施例中的黄精药材来自湖北恩施。实施例1一种黄精多糖的制备方法，包括如下步骤：(1)将黄精生药材洗净，加水浸泡15分钟后堆积在干净的台面上6h，用湿布遮盖，期间喷洒适量清水，保持湿润状态，使药材外部的水分徐徐渗透到药物组织内部，使药材润至无干心；然后置于蒸笼中蒸，水开后继续蒸6h，至药材呈黄黑色、柔软状，关火继续焖6h至外表棕黑色、有光泽，出锅，晾至黄精外干内润，然后切成3～5mm厚片，置于70℃恒温烘干箱烘干。(2)取切片磨成粉末，先用95％乙醇((V/V，本说明书中所述乙醇的百分比浓度均指体积百分比浓度，后文不赘述)在60℃下回流3h，脱脂，再用80％乙醇于60℃回流2h，脱单糖和低聚糖，然后过滤，将药渣烘干(45℃)，加入蒸馏水(药渣与每次加入的蒸馏水用量比为1g:25mL)，于80℃下回流提取3次，每次3h。过滤，合并滤液浓缩至浸膏状态，加入乙醇，使含醇量为80％，搅拌均匀，在4℃放置过夜，过滤，将沉淀烘干，即得粗多糖。所得粗多糖用Sevage法除去蛋白，取除去蛋白后的多糖，加适量热水(60℃)溶解，于流水中透析48h；取透析液真空冷冻干燥，即得精多糖(黄精多糖)。所得黄精多糖按照硫酸-蒽酮法显色后于627nm处测吸光度，用葡萄糖标准品做多糖标准曲线，测得黄精总多糖含量为96.9％。实施例2黄精多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠的调节作用1.实验动物和试剂8周龄SPF级雄性昆明小鼠(22±2)g，购自湖北省疾病预防控制中心，小鼠适应性喂养3天后开始实验。黄精多糖：实施例1制备，刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)购自Sigma-Adrich(St.Louis，Missouri，USA)；IL-1β、IL-6和TNF-α含量测定ELISA试剂盒购于南京建成生物研究所。PBS缓冲液：0.01M，pH＝7.4。MTT溶液：将250mgMTT加入50mLPBS缓冲液中使其完全溶解，微孔滤膜过滤后，放入-20℃冰箱避光保存。2.方法2.1动物分组与模型制备方法取昆明小鼠50只，随机分为正常对照组、模型组、黄精多糖低、中、高剂量组(剂量分别为50、100、150mg/kg)，每组10只。正常组小鼠每天腹腔注射生理盐水(0.01mL/g)，其他各组每只小鼠腹腔注射环磷酰胺(2mg/d)，连续3d，建立免疫抑制模型。第4天开始，正常组和模型组小鼠每天灌胃生理盐水(0.01mL/g)，其他各组分别每天灌胃相应剂量黄精多糖溶液(0.01mL/g)(实施例1制备的黄精多糖用双蒸水配制而成)，连续1周。2.2巨噬细胞悬液的制备(1)将5mL的RPMI-1640培养液注射入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部，15min后收集腹腔液，用RPMI-1640培养液漂洗细胞悬液2次；(2)然后将细胞悬液重悬于RPMI-16本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄精多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

【技术特征摘要】
1.一种黄精多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将黄精生药材洗净，加水泡后堆积在干净的台面上，用湿布遮盖，期间喷洒清水，润至药材内无干心，然后蒸至黄黑色、柔软为度，关火继续焖至外表棕黑色，有光泽，出锅，晾至外干内润，切3～5mm厚片，烘干；（2）取步骤（1）的切片，研成粉末，用80~95v/v%的乙醇水溶液回流提取2-3次，过滤，所得药渣烘干；（3）向步骤（2）的烘干后的药渣中加入蒸馏水，于80℃回流提取2-4次，过滤，滤液浓缩至浸膏状态后，加入乙醇，至乙醇含量为70-90v/v%，搅拌均匀，然后于4℃下放置8-12h，过滤，沉淀烘干，即得粗多糖；（4）将步骤（3）所得粗多糖用Sevage法除去蛋白；（5）将步骤（4）除去蛋白后的多糖用水溶解后，于流水中透析48h；取透析液真空冷冻干燥，得到黄精多糖。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中在蒸笼中蒸4～8h，关火继续焖4～8h，出锅。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述烘干为置于恒...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓旭坤，段欢，吕晓宇，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42