一种具有免疫调节作用的大石花菜多糖的制备方法及结构部分表征及其应用技术

本发明专利技术涉及一种大石花菜多糖及其制备方法和用途，属于天然高分子领域。本发明专利技术提供一种从大石花菜中提取分离多糖的方法、该多糖的化学结构及其用途。利用GPC测定平均相对分子量和GC‑MS分析单糖组成，发现本发明专利技术大石花菜多糖A‑11平均相对分子量为28807Da，主要由木糖和半乳糖组成，还发现痕量的鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、阿洛糖、果糖，葡萄糖和甘露糖。同时，本发明专利技术的大石花菜多糖A‑11，显著抑制LPS诱导THP‑1产生的细胞毒性，保护细胞免受损害；又能够调节免疫信号通路中信号因子MyD88和TRAF‑6的表达从而提高人体免疫力。 1

Preparation, structure characterization and application of Polysaccharides from cauliflower with immunomodulatory effect

The invention relates to a polysaccharide from cauliflower and its preparation method and application, which belongs to the field of natural polymers. The invention provides a method for extracting and separating polysaccharides from cauliflower, the chemical structure and uses of the polysaccharide. The average relative molecular weight and GC MS analysis of monosaccharides were measured by GPC. The average relative molecular weight of the polysaccharide A 11 was 28807Da, mainly composed of xylose and galactose, and trace amount of rhamnose, Arabia sugar, fucose, alosose, fructose, glucose and mannose. At the same time, the polysaccharide of cauliflower A 11, significantly inhibits the cytotoxicity of LPS induced by THP 1, protects the cells from damage, and can also regulate the expression of the CITIC factor MyD88 and TRAF 6 of the immune signal pathway to improve the human immunity. One

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫调节作用的大石花菜多糖的制备方法及结构部分表征及其应用
本专利技术涉及天然高分子
，具体地说，是一种大石花菜多糖的制备方法、结构部分表征和用途。
技术介绍
石花菜，又名海冻菜、石华、琼枝、草珊瑚、鸡毛菜等，主要分布在我国的台湾岛、海南岛以及广东沿岸，目前是制作琼胶的主要原料。据中医典籍记载，石花菜可用于治疗支气管炎、瘿瘤、肠炎、痔血等，是一种药食兼用的藻类。目前石花菜的主要利用方式有直接食用及制作琼胶，广泛应用在食品化工等行业。石花菜多糖已有一定研究，研究表明，石花菜多糖具有良好的生物活性，例如抗氧化活性、降血糖活性、降血脂活性、抑菌活性等。大石花菜同属石花菜，产于中国浙江、福建沿海，是北太平洋西部特有的种。目前，对大石花菜的研究主要集中在养殖技术及范围分布方向，中国专利文献CN107259558A公开了一种采用酶解的方法从石花菜中提取多糖。而关于本专利技术的大石花菜多糖的提取制备、纯化以及其具有的生理活性方面在国内外尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种大石花菜多糖的制备方法。本专利技术的第二个目的是，提供一种大石花菜多糖。本专利技术的第三个目的是，提供一种大石花菜多糖的应用。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种具有免疫调节作用的大石花菜多糖的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：(1)大石花菜的水提液浓缩后加入乙醇，收集沉淀；(2)步骤(1)获得的沉淀去除蛋白质得到大石花菜粗多糖；(3)步骤(2)获得的大石花菜粗多糖经阴离子交换柱层析得到大石花菜多糖A-1；(4)大石花菜多糖A-1经凝胶柱层析得到大石花菜纯多糖A-11，即具有免疫调节作用的大石花菜多糖。优选地，步骤(2)通过Sevage法去除蛋白质。优选地，步骤(3)为：步骤(2)获得的大石花菜粗多糖经DEAE-52阴离子交换柱层析、浓缩、透析、冷冻干燥得到大石花菜多糖A-1。优选地，步骤(4)为：大石花菜多糖A-1经SephadexG-100凝胶柱层析、浓缩、透析、冷冻干燥得到大石花菜纯多糖A-11，即具有免疫调节作用的大石花菜多糖。优选地，步骤(3)的柱层析步骤中依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/LNaCl溶液洗脱；步骤(4)的柱层析步骤中用0.3mol/LNaCl溶液洗脱。优选地，所述的制备方法包括如下步骤：(1)将干燥大石花菜粉碎、过20目筛；大石花菜粉末按照料液比1:30，80℃超声辅助提取2.5小时，得水提液，60℃减压浓缩，向浓缩液加入两倍体积的无水乙醇，室温下静置12小时沉淀多糖，8000rpm、10分钟、4℃离心收集沉淀；(2)蒸馏水溶解沉淀，使用Sevage法除去水提液蛋白质，静置12小时，8000rpm离心10分钟取上清液，随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩冷冻干燥得粗多糖；(3)取上述粗多糖配置成浓度为20mg/mL的溶液，0.45μm滤膜过滤后，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，上样量为5mL，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/LNaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，6分钟每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第50-80管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得到大石花菜多糖A-1；(4)上述大石花菜多糖A-1配置成浓度为50mg/mL的溶液，0.22μm滤膜过滤后，经SephadexG-100柱分离，上样量为5mL，用0.3mol/LNaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，6分钟每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第5-35管合并后经浓缩、透析、冷冻干燥分别得大石花菜纯多糖A-11，即具有免疫调节作用的大石花菜多糖。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：上述制备方法制得的具有免疫调节作用的大石花菜多糖。进一步地，所述的具有免疫调节作用的大石花菜多糖的平均相对分子量为28807Da，主要由木糖和半乳糖组成，以及痕量的鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、阿洛糖、果糖，葡萄糖和甘露糖。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的具有免疫调节作用的大石花菜多糖在制备免疫调节剂中的应用。所述的具有免疫调节作用的大石花菜多糖在制备抗肿瘤的药物或食品中的应用。本专利技术优点在于：1、本专利技术从大石花菜中分离出多糖，测定其平均相对分子量，分析其单糖组成并确定其具体的活性用途。2、本专利技术从大石花菜多糖中分离的多糖A-11，经GPC测定，A-11的平均相对分子量为28807Da，主要由木糖和半乳糖组成，还发现痕量的鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、阿洛糖、果糖，葡萄糖和甘露糖。3、本专利技术发现大石花菜多糖A-11可显著抑制LPS诱导THP-1细胞产生的细胞毒性。随着多糖浓度的不断增大(1-25ug/mL)，大石花菜多糖能剂量依赖性地抵抗LPS诱导的细胞毒。低剂量(1ug/mL)的大石花菜多糖即可对LPS诱导的细胞毒性产生抵抗作用，多糖抵抗毒性作用随着多糖浓度增加而增大，当多糖浓度达到5ug/mL时能够完全抵抗LPS诱导THP-1产生的细胞毒性。4、本专利技术发现大石花菜多糖A-11能够影响免疫信号通路中TLR-4、MyD88和TRAF-6因子的表达从而提高人体免疫力。大石花菜多糖能够明显抑制LPS诱导THP-1细胞中TLR-4、MyD88和TRAF-6的活化，从而抑制炎症持续进行，提高人体免疫力，促进免疫恢复。附图说明附图1是大石花菜多糖的提取流程图附图2是大石花菜多糖A的DEAE-52柱洗脱曲线附图3是大石花菜多糖A-1的SephadexG-100柱洗脱曲线附图4是大石花菜多糖A-11细胞活性的影响图附图5是大石花菜多糖A-11的GPC测定的结果图附图6是大石花菜多糖A-11的GC-MS测定的结果图附图7是大石花菜多糖A-11对LPS诱导NO产生的影响图。附图8是大石花菜多糖A-11的免疫通路mRNA水平研究图。附图9是大石花菜多糖A-11的免疫通路mRNA水平研究图。附图10是大石花菜多糖A-11的免疫通路mRNA水平研究图。附图11是大石花菜多糖A-11的免疫通路蛋白水平研究图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1一、提取流程将干燥大石花菜手工去杂、浸泡去杂，干燥、粉碎、过20目筛，大石花菜粉末先浸泡20min，按照料液比1:30，80℃超声辅助提取2.5h，得水提液，60℃减压浓缩，得浓缩液。向浓缩液加入两倍体积的无水乙醇，室温下静置12h沉淀多糖，8000rpm，10min，4℃离心收集沉淀，得粗多糖。将粗多糖溶解于蒸馏水中，利用Sevage法除蛋白，向浓缩液加入终浓度为3％的三氯乙酸，静置12h，8000rpm离心10min，取上清。随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩，冷冻干燥得粗多糖。取上述粗多糖0.2g，配置成浓度为20mg/mL的溶液，上样量为5mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/LNaCl，溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，6min每管；采用苯酚-硫酸法检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有免疫调节作用的大石花菜多糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫调节作用的大石花菜多糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：(1)大石花菜的水提液浓缩后加入乙醇，收集沉淀；(2)步骤(1)获得的沉淀去除蛋白质得到大石花菜粗多糖；(3)步骤(2)获得的大石花菜粗多糖经阴离子交换柱层析得到大石花菜多糖A-1；(4)大石花菜多糖A-1经凝胶柱层析得到大石花菜纯多糖A-11，即具有免疫调节作用的大石花菜多糖。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)通过Sevage法去除蛋白质。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)为：步骤(2)获得的大石花菜粗多糖经DEAE-52阴离子交换柱层析、浓缩、透析、冷冻干燥得到大石花菜多糖A-1。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)为：大石花菜多糖A-1经SephadexG-100凝胶柱层析、浓缩、透析、冷冻干燥得到大石花菜纯多糖A-11，即具有免疫调节作用的大石花菜多糖。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的柱层析步骤中依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/LNaCl溶液洗脱；步骤(4)的柱层析步骤中用0.3mol/LNaCl溶液洗脱。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：(1)将干燥大石花菜粉碎、过20目筛；大石花菜粉末按照料液比1:30，80℃超声辅助提取2.5小时，得水提液，60℃减压浓缩，向浓缩液加入两倍体积的无水乙醇，室温下静置12小时沉淀多糖，8000rpm、10分钟、4℃离心收集沉淀；(2)蒸馏水溶解沉淀，使用Sevage法除去水提液蛋白质，静置1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克海，崔明晓，邹颖，邬军文，张敏，王玉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31