一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，包括如下步骤：1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30‑90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max‑5×T1max)；4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法
本专利技术具体涉及一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法。技术背景人参皂苷(ginsenoside)为四环三萜达玛烷型皂苷，人参的特征性化学成分，具有改善免疫功能、提高记忆、延缓衰老、改善心血管功能等作用。人参GinsengRadixetRhizoma，五加科人参属植物人参PanaxginsengC.A.Meyer的干燥根和根茎，传统名贵中药，《神农本草经》列为上品，载其“味甘，微寒，主补五脏，安精神，开心益智，久服轻身延年”，中国药典2015版载其“大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智”，为广为认可的补益药之一。目前，人参皂苷含量测量主要使用反相高效(超高效)液相色谱仪，配合DAD或者ELSD检测器，或者高效液相色谱串联质谱法进行测定。这些分析测试方法均需要高纯度标准品作对照，并且杂质与目标物响应值有差异，会影响其准确性。氢核磁定量分析技术(Quantitativehydrogennuclearmagneticresonancespectroscopy)，是基于核磁共振原理的一种定量分析方法，其原理是不同化学环境的氢原子的共振峰面积，只与其原子数目有关。方法简单、快捷，不破坏样品，可以不使用待测组分的对照品，而使用已知含量的普通化学物质为参比，相比于高效液相色谱法、气质及液质联用等定量技术具有独特的优势。但目前没有运用氢核磁定量分析技术对人参皂苷Rd含量测定的相关方法。
技术实现思路
核磁定量的原理是在适当的仪器参数条件下含氢有机化合物1HNMR波谱信号直接与原子数目成正比，因此在实验参数设定时，需要被测物与内标物上的共振峰与其对应的原子数尽可能保持一致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，杂质、组分、内标物和溶剂信号容易相互干扰或重叠，导致积分不准确，影响结果的可靠性。人参皂苷Rd的分子量高达946，其化学结构式如(图1)所示，含有众多羟基活泼氢，采用氢核磁定量分析技术进行测定时，信号重叠严重。含有活泼氢的氘代溶剂可以抑制化合物活泼氢信号，专利技术人经过研究发现，人参皂苷Rd信号在加入一定量重水之后，活泼氢信号被抑制。但重水H信号随着重水比例的变化而发生移动，且当重水比例少，活泼氢信号抑制不完全，定量峰积分准确度受影响，重水比例大，重水信号会掩盖定量峰或造成定量峰附近基线不平，选择对人参皂苷合适的重水比例对核磁共振分析具有重要意义。同时，不同位移峰都会对应不同的倾倒角和弛豫时间等参数，选择对定量峰合适的脉冲倾倒角和弛豫时间，是目前限制采用氢核磁共振测定人参皂苷Rd纯度的技术难题之一。而脉冲倾倒角和弛豫时间是建立氢核磁共振定量方法中的两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，而在之前运用氢核磁共振分析对照品的方法中，这两个参数常被忽视，导致方法的准确性和便捷性受到影响。为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，包括如下步骤：1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max-5×T1max)；4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。优选的，步骤1)中，所述溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)与重水的混合溶剂，氘代二甲基亚砜与重水的体积比为5～10:1，优选为8～10：1，进一步为9:1。氘代DMSO性质稳定、不易挥发，对被测样品和内标物溶解性良好，为核磁定量的合适溶剂。单独以氘代DMSO为溶剂时，待测样品图谱中人参皂苷Rd定量峰旁边存在活泼氢信号的干扰峰。采用在DMSO加入一定量重水的混合溶剂可以屏蔽人参皂苷Rd活泼氢信号，解决了人参皂苷Rd自身信号重叠的问题(图2)。专利技术人经过摸索发现，当使用DMSO和重水混合溶剂时，若重水比例较少，则对活泼氢信号抑制不完全，当重水比例过大，重水信号掩盖定量峰或造成定量峰附近基线不平，重水H信号随着重水比例的变化而发生移动，最终选定合适混合溶剂比例(图3)。优选的，步骤2)中，所述定量目标峰为人参皂苷Rd的第24位质子峰。需要说明的是，核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波普信号直接与原子数目成正比，若选择不合适位置的氢进行纯度测定，会导致积分不准确，检测结果重现性差。本专利技术中人参皂苷Rd的分子量为946，结构式如
技术介绍
中所示，实际上除了众多羟基活泼氢，人参皂苷Rd还有约69个氢信号，每一位移峰都会对应不同的倾倒角和弛豫延迟时间等参数，选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核磁共振测定人参皂苷Rd纯度的技术难题之。优选的，步骤2)中，核磁共振波谱仪的参数为：测定温度25℃，观测频率400.13MHz，脉冲宽度11.8μs，采集时间4.0894s，累加次数设定为8～128，所述倾倒角为30°，70°或90°，所述弛豫延迟时间(d1)设定6～100s。脉冲倾倒角和弛豫延迟时间是建立氢核磁共振定量方法过程中两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前也有研究它们与检测结果关系的文献报道，在实际测定纯度时有一个公认测定步骤：将内标物与待测物质溶解于溶剂中，进行仪器参数设定的测量，在进行参数的测定时将脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等同于共振频率等参数进行设定，导致方法准确性存在盲目性。本专利技术人在研究中克服了技术偏见。本专利技术测定了人参皂苷Rd样品及内标物的定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T1)，并确定了在脉冲倾倒角30-90°时弛豫延迟时间，使检测人参皂苷Rd纯度结果更准确。当采用90°脉冲时，具有较好的灵敏度，但此时d1≥5×T1max是确保含量测定数据准确性的必要条件，分析时间较长，核磁定量快速性的优点得不到发挥；当采用较小的脉冲倾倒角时，如30脉冲，d1≥(7/3)×T1max就能获得准确的分析结果，且分析时间大大缩短。因此，本专利首先通过测量定量目标信号的纵向弛豫时间(T1)，按倾倒角30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3)×T1max-5×T1max的原则优化脉冲倾倒角、弛豫延迟时间(d1)等参数，在确保方法准确性的前提下，尽量采用较小的弛豫延迟时间，提高分析样品的效率。优选的，步骤1)中，所述内标物为苯甲酸。苯甲酸的信号范围较人参皂苷Rd位于低场，有利于提高内标物和样品信号的分离度，且具有廉价易得、信号简单、化学性质稳定等优点。优选的，步骤3)中，所述积分面积为每一信号6次积分的平均值。优选的，步骤4)中，人参皂苷Rd纯度的计算公式为：式中，ws样品的质量分数，wr内标物质量分数，As和ns分别为被测定样品的定量峰积分面积及定量峰包含质子数，Ar和nr分别为内标物质的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30‑90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max‑5×T1max)；4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。

【技术特征摘要】
1.一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)测定人参皂苷Rd和内标物在不同溶剂中出峰情况，选定溶剂和定量峰；2)测定人参皂苷Rd和内标物定量目标峰在选定溶剂中的纵向弛豫时间T1；3)根据T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间，倾倒角为30-90°，弛豫延迟时间d1≥(7/3×T1max-5×T1max)；4)根据步骤2)所设定的参数测定样品和内标物中各定量目标峰的积分面积，得出人参皂苷Rd相对于内标物的摩尔比；5)根据内标物的质量，计算人参皂苷Rd的质量，然后计算人参皂苷Rd的纯度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述溶剂为氘代二甲基亚砜与重水的混合溶剂，氘代二甲基亚砜与重水的体积比为5～10:1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：氘代二甲基亚砜与重水的体积比为8～10：1。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：氘代二甲基亚砜与重水的体积比为9:1。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿岩玲，闫慧娇，王志伟，赵恒强，纪文华，林云良，王晓，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东,37