家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；并提供了其表达载体pFBDM‑LP19‑Fluc‑IG和应用；表达载体通过转座的方式，利用asd缺失型rSW106‑inv菌感染Sf9细胞和BmN细胞获得重组杆状病毒，将重组病毒分别重新感染Sf9细胞和家蚕幼虫后，通过荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的活性。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，证实了启动子LP19可在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中驱动外源基因进行表达，丰富了昆虫—杆状病毒表达系统中基因启动子的选择，为LP19启动子在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；表明LP19启动子在杆状病毒表达系统生产重组药物、疫苗等方面，具有良好的应用潜力。

Bombyx mori 30K protein 19G1 promoter LP19 and its expression vector and Application

The present invention discloses the promoter LP19 of the 30K protein 19G1 gene of the silkworm, and the promoter nucleotide sequence, such as SEQ ID NO:1, and provides the expression vector pFBDM LP19 Fluc Fluc IG and its application. The recombinant virus was re infected with Sf9 cells and silkworm larvae. Luciferase reporter assay kit was used to detect the activity of luciferase. The beneficial effect of the invention is that the 30K protein 19G1 gene promoter LP19 of the silkworm, and its expression vector and application, confirm that the promoter LP19 can express the exogenous gene in the Sf9 insect cells and the silkworm larvae, and enrich the selection of the gene promoter in the insect baculovirus expression system, which is the promoter of the LP19 promoter. The application of baculovirus expression in the expression of exogenous proteins provides a basis for the application of LP19 promoter in the production of recombinant drugs and vaccines in baculovirus expression system, which has a good potential for application.

【技术实现步骤摘要】
家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用。
技术介绍
昆虫基因启动子是位于结构基因5'端上游的能与RNA聚合酶结合并启动转录的一段特定DNA序列。该序列在昆虫基因的表达调控中起着关键作用：决定着下游基因转录的特异性、方向和效率。此外，昆虫基因启动子在构建外源基因的表达载体的过程中具有重要作用，它决定了外源基因表达的时空顺序、表达强度、转录效率和基因的表达水平。所以，研究昆虫启动子的功能对于基因的表达调控机制和昆虫基因工程技术的发展具有十分重要的科学意义。研究表明昆虫基因启动子存在多种特征元件，通过与RNA聚合酶识别、结合，从而启动目的基因的转录过程。昆虫基因启动子具备真核生物启动子的典型特征，一般具有以下结构：(1)转录起始位点：通常位于翻译起始密码子(AUG)上游-40～-70bp处。大多数情况下(＞90％)转录起始位点周围为嘌呤残基；(2)TATAbox：一般位于-25～-35bp处，其一致性序列为TATAWAW(W代表A或T)。TATAbox并不是一成不变的，其中在真核生物中有43％的结构基因启动子中有TATAbox；(3)CAGTbox：通常位于TATAbox上游-10～-40bp处，对它的缺失或突变会影响启动子活性。除此之外，有的昆虫基因启动子还具有GCbox、CAATbox等基本转录调控元件和其它的一些组织特异型调控元件。当前，随着分子生物学技术的迅速发展和昆虫基因组研究的日益成熟，利用昆虫--杆状病毒表达系统进行药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等方面的研究得到了广泛的关注。杆状病毒表达系统使用较多的启动子是多角体(polh)启动子和p10启动子，目前已经成功表达了上千种外源蛋白，但是如何提高外源蛋白表达量和组织表达特异性仍然制约着昆虫--杆状病毒表达系统的大规模推广应用。为了更好的利用昆虫--杆状病毒表达系统生产外源蛋白，国内外许多学者采取优化启动子的方法对杆状病毒进行改造。因此，发掘昆虫中新的启动子，并对其启动子活性进行研究，对昆虫--杆状病毒表达系统的发展具有重要的经济价值和应用价值。家蚕是鳞翅目的模式昆虫，其血液中有有一些含量丰富的蛋白质。其中，30K蛋白因其分子质量而得名，是家蚕末龄后期至蛹期血液中含量最高的一类蛋白质。其中，载脂蛋白19G1被认为是属于的与结构相关“30K蛋白”，是五龄幼虫及蛹中主要的蛋白组分，大量分布在血淋巴和卵细胞中。因此，位于家蚕30K蛋白19G1基因上游的启动子作为重要的表达调控元件，克隆其启动子核苷酸序列，研究其在外源蛋白表达载体中的活性，可以为昆虫--杆状病毒表达系统提供重要的启动子序列资源。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，以丰富昆虫--杆状病毒表达系统中基因启动子的选择。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，所述的启动子核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二个目的是提供了含有上述的启动子LP19的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。本专利技术的第三个目的是提供了上述重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建方法，是将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，即得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。其中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表达。本专利技术的第四个目的是提供了用于扩增上述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19的PCR特异性引物，所述正向引物LP19F的序列如序列表中SEQIDNO：2所示，为5'-atcgcgaaccagcaggatggttctg-3'；反向引物LP19R的序列如序列表中SEQIDNO：3所示，为5'-aggatcctttggagcgtcgagtcctgc-3'。本专利技术的第五个目的是提供了上述家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在调控目的基因表达中的应用。进一步的，上述的应用，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。本专利技术的第六个目的是提供了上述家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在杆状病毒表达系统构建中的应用。证实了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中能够驱动外源基因的高效表达，为其在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)；杆状病毒构建方法为Bac-to-Bac法。进一步的，上述的应用，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在Sf9细胞中表达；Sf9细胞株为草地夜蛾细胞系Sf9。进一步的，上述的应用，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染BmN细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在家蚕幼虫中表达；BmN细胞株为家蚕细胞系BmN。进一步的，上述的应用，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，证实了启动子LP19可在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中驱动外源基因进行表达，丰富了昆虫—杆状病毒表达系统中基因启动子的选择，为LP19启动子在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；表明LP19启动子在杆状病毒表达系统生产重组药物、疫苗等方面，具有良好的应用潜力。附图说明图1为家蚕LP19启动子的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1、2为LP19启动子基因，M1为DL5000DNAMarker。图2为pFBDM-LP19-Fluc-IG载体结构示意图。图3为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒NruI/BamHI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为DL10000DNAMarker，1为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒，2为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒NruI/BamHI双酶切产物。图4为重组杆状病毒AcMNPV-LP19-Fluc感染Sf9细胞后Fluc的表达量。重组病毒按照MOI＝5的比本文档来自技高网...

【技术保护点】
家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，其特征在于，所述的启动子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，其特征在于，所述的启动子核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。2.含有如权利要求1所述的启动子LP19的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建方法，其特征在于，是将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，即得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。4.用于扩增如权利要求1所述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19的PCR特异性引物，其特征在于，所述正向引物LP19F的序列如序列表中SEQIDNO：2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伦广，刘阳坤，李娜，胡小敏，王铁军，程天才，尹延震，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41