用于癌症免疫疗法的CRISPR-CAS相关方法、组合物和组分技术

用于治疗癌症的CRISPR/Cas相关组合物和方法，具体地通过使用包含与来自FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因的靶结构域互补的靶向结构域的gRNA分子。在一些实施例中，将gRNA与Cas9酶一起使用，以在工程化的嵌合抗原受体(CAR)T细胞内在所述基因中导致切割事件。在一些实施例中，CAR T细胞被修饰成使用gRNA和Cas9酶减少、降低或阻遏所述基因的表达；所述修饰的CAR T‑细胞用于治疗用途，尤其是用于癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症免疫疗法的CRISPR-CAS相关方法、组合物和组分相关申请的交叉引用本申请要求2014年4月18日提交的美国临时申请序列号61/981,636、和2015年3月25日提交的美国临时申请序列号62/138,246的权益，将其披露通过引用而特此结合。序列表本说明书参考了序列表(在2015年4月17日以名为“SEQUENCELISTING2011271-0005EM034PCT.txt”的.txt文件电子提交)。所述.txt文件生成于2015年4月17日并且大小为11,400,000个字节。将序列表的整个内容通过引用而特此结合。专利
本专利技术涉及用于编辑靶核酸序列或调节靶核酸序列表达的CRISPR/CAS相关方法、组合物和组分，及其与包含工程化T细胞或T细胞前体的过继性转移的癌症免疫疗法的结合应用。背景基因工程化T细胞的过继性转移已经作为癌症治疗模式进入临床测试。典型地，所述途径由以下步骤组成：1)通过单采从受试者获得白细胞；2)选择/富集T细胞；3)通过细胞因子处理激活T细胞；4)通过逆转录病毒转导、慢病毒转导或电穿孔引入经克隆的T细胞受体(TCR)基因或嵌合抗原受体(CAR)基因；5)通过细胞因子处理扩增T细胞；6)调理受试者，通常通过淋巴细胞耗减(lymphodepletion)；并且7)将工程化T细胞输注到受试者体内。经克隆的TCR基因(TRAC和TRBC)的来源包括从患有具体恶性肿瘤的个体中分离的稀有T细胞群以及从用特定肿瘤抗原或肿瘤细胞免疫的T细胞受体人源化小鼠中分离的T细胞克隆。过继性转移后，TCR工程化T细胞识别肿瘤细胞表面上的由主要组织相容性复合物(MHC)蛋白呈递的其同源抗原肽。抗原接合刺激信号转导通路，引起T细胞激活和增殖。经刺激的T细胞然后使细胞毒性抗肿瘤细胞应答增加，典型地涉及包含颗粒酶B、穿孔素和粒溶素的分泌复合物，从而诱导肿瘤细胞凋亡。嵌合抗原受体(CAR)基因编码包含经由铰链和跨膜结构域与胞质效应结构域融合的胞外肿瘤抗原结合结构域的人工T细胞受体，所述胞外肿瘤抗原结合结构域典型地衍生自单克隆抗体的单链抗体可变片段(scFv)结构域。所述效应结构域典型地衍生自T细胞辅助受体复合物的CD3-ζ链，并且还可以包括衍生自CD28和/或CD137受体蛋白的结构域。所述CAR胞外结构域以MHC非依赖性方式结合肿瘤抗原，引起T细胞激活和增殖，以如针对TCR工程化T细胞所描述的细胞毒性抗肿瘤活性告终。迄今为止，已经在工程化T细胞的临床试验中靶向了至少15种不同的肿瘤抗原。在若干试验中，已经报告了抗肿瘤活性。已经在恶性血液病中实现了最大成功。例如，被工程化为靶向B细胞抗原CD19的CAR-T细胞的过继性转移在患有淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和B-细胞急性淋巴细胞白血病的受试者体内导致了多种部分和完全应答。相比之下，靶向其他肿瘤类型尤其是实体瘤(包括肾细胞癌、成神经细胞瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤和前列腺癌)的试验一直不太成功。在许多这些试验中，非常少的患者经历了客观应答。因此，需要改进过继性转移的工程化T细胞的抗肿瘤功效。概述在此所讨论的方法和组合物提供了使用免疫疗法途径治疗癌症，所述免疫疗法途径包括向受试者给予基因工程化T细胞或T细胞前体。治疗患有癌症的受试者的途径是从所述受试者体内分离T细胞，将它们基因修饰成靶向由癌细胞表达的抗原，然后将它们重新引入所述受试者体内；一种称为过继性细胞转移的过程。用于基因修饰T细胞的方法包括引入对应地编码跨膜TCR或CAR蛋白的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)基因，所述TCR或CAR蛋白特异性地识别特定癌症抗原。虽然不希望受理论束缚，认为肿瘤表达的抗原与TCR或CAR蛋白的抗原结合结构域的接合启动信号传导级联，引起T细胞激活、增殖，并且最终经由细胞毒性免疫应答引起癌细胞的破坏(克肖(Kershaw)等人，2013癌症自然评论(NatRevCancer)13，525-541)。利用基因修饰T细胞的过继性细胞转移已经作为实体恶性肿瘤和恶性血液病的治疗剂进入临床测试。迄今为止结果不一。在恶性血液病(尤其是淋巴瘤、CLL和ALL)中，大多数患者在若干1期和2期试验中至少展现出部分应答，一些患者展现出完全应答(科亨德佛(Kochenderfer)，J.N.等人，2012血液(Blood)119，2709-2720)。然而，在大部分肿瘤类型(包括黑色素瘤、肾细胞癌和结肠直肠癌)中，观察到了较少的应答(约翰逊(Johnson)，L.A.等人，2009血液(Blood)114，535-546；拉默斯(Lamers)，C.H.等人，2013分子疗法(MoL.Ther.)21，904-912；沃伦(Warren)，R.S.等人，1998癌症基因疗法(CancerGeneTher.)5，S1-S2)。因此，需要改进经修饰T细胞的过继性转移在癌症治疗中的功效。限制基因修饰T细胞作为癌症治疗剂的功效的因素包括(1)T细胞增殖，例如过继性转移后T细胞增殖受限；(2)T细胞存活，例如肿瘤环境中的因子诱导T细胞凋亡；以及(3)T细胞功能，例如由宿主免疫细胞和癌细胞分泌的抑制因子对细胞毒性T细胞功能的抑制。在此所描述的方法和组合物通过修饰影响T细胞增殖、存活和/或功能的T细胞表达的基因的表达而解决了这些限制。在实施例中，在此所讨论的方法和组合物可以用于影响T细胞增殖(例如，通过使抑制T细胞增殖的基因失活)。在实施例中，在此所讨论的方法和组合物可以用于影响T细胞存活(例如，通过使介导T细胞凋亡的基因失活)。在实施例中，在此所讨论的方法和组合物可以用于影响T细胞功能(例如，通过使编码免疫抑制和抑制性(例如，无反应性-诱导型)信号传导因子的基因失活)。在此考虑了，上文所描述的方法和组合物可以单独地或组合地用于影响限制基因修饰T细胞作为癌症治疗剂的功效的因素中的一个或多个，例如T细胞增殖、T细胞存活、T细胞功能、或其任何组合。在此所讨论的方法和组合物可以用于通过改变一个或多个T-细胞表达的基因(例如，FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC和/或TRBC基因中的一个或多个)而影响T细胞增殖、存活和/或功能。在实施例中，在此所描述的方法和组合物可以用于通过改变一个或多个T-细胞表达的基因(例如，CBLB和/或PTPN6基因)而影响T细胞增殖。在实施例中，在此所描述的方法和组合物可以用于通过改变一个或多个T-细胞表达的基因(例如，FAS和/或BID基因)而影响T细胞存活。在实施例中，在此所描述的方法和组合物可以用于通过改变一个或多个T-细胞表达的基因(例如，CTLA4和/或PDCD1和/或TRAC和/或TRBC基因)而影响T细胞功能。在一种途径中，一个或多个T-细胞表达的基因(例如，FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC和/或TRBC基因)作为靶向敲除或敲低被独立地靶向，例如以影响T细胞增殖、存活和/或功能。在实施例中，所述途径包括敲除或敲低一个T-细胞表达的基因(例如，FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因)。在另一个实本文档来自技高网...

【技术保护点】
gRNA分子，所述gRNA分子包含与来自FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因的靶结构域互补的靶向结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.18 US 61/981,636;2015.03.25 US 62/138,2461.gRNA分子，所述gRNA分子包含与来自FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因的靶结构域互补的靶向结构域。2.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域被配置成在T细胞靶敲除位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。3.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域被配置成靶向足够接近T细胞靶敲低位置的无酶促活性Cas9(eiCas9)或eiCas9融合蛋白，以减少、降低或阻遏FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的表达。4.如权利要求3所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域被配置成靶向FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的启动子区。5.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域包含与来自表1A-I、表2A-I、表3A-H、表4A-I、表5A-I、表6A-I、表7A-H、表8A-H、表9A-I、表10A-I、表11A-I、表12A-I、表13A-K、表14A-K、表15A-F、表16A-K、表17A-K、表18A-K、表19A-J、表20A-J、表21A-K、表22A-K、表23A-J、表24A-K、表25A-G、表26A-G、表27、表29、表31、或表32中任一项的靶向结构域序列相同、或与之相差不多于3个核苷酸的序列。6.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表1A-F或表13A-K中的那些。7.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表2A-I或表14A-K中的那些。8.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表3A-H或表15A-F中的那些。9.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表4A-I或表16A-K中的那些。10.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表5A-I或表17A-K中的那些。11.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表6A-I或表18A-K中的那些。12.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表7A-H、表19A-J、表31或表32中的那些。13.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表8A-H或表20A-J中的那些。14.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表9A-I或表21A-K中的那些。15.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表10A-I或表22A-K中的那些。16.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表11A-I或表23A-J中的那些。17.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表12A-I或表24A-K中的那些。18.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表25A-G或表29中的那些。19.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域选自表26A-G或表27中的那些。20.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是模块化gRNA分子。21.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是嵌合gRNA分子。22.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个或更多个核苷酸。23.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个核苷酸。24.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是18个核苷酸。25.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是19个核苷酸。26.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是20个核苷酸。27.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是21个核苷酸。28.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是22个核苷酸。29.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是23个核苷酸。30.如权利要求1-19中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是24、25、或26个核苷酸。31.如权利要求1-30中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子从5’到3’包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；近端结构域；以及尾部结构域。32.如权利要求1-30中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。33.如权利要求1-30中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。34.如权利要求1-30中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少35个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。35.如权利要求1-30中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。36.核酸，所述核酸包含：(a)编码gRNA分子的序列，所述gRNA分子包含与FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因中的T细胞靶结构域互补的靶向结构域。37.如权利要求36所述的核酸，其中所述gRNA分子是如权利要求1-35中任一项所述的gRNA分子。38.如权利要求36所述的核酸，其中所述靶向结构域被配置成在所述T细胞靶敲除位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。39.如权利要求36所述的核酸，其中所述靶向结构域被配置成靶向足够接近T细胞靶敲低位置的无酶促活性Cas9(eiCas9)或eiCas9融合蛋白，以减少、降低或阻遏FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的表达。40.如权利要求36所述的核酸，其中所述靶向结构域被配置成靶向FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的启动子区。41.如权利要求36所述的核酸，其中所述靶向结构域包含与来自表1A-I、表2A-I、表3A-H、表4A-I、表5A-I、表6A-I、表7A-H、表8A-H、表9A-I、表10A-I、表11A-I、表12A-I、表13A-K、表14A-K、表15A-F、表16A-K、表17A-K、表18A-K、表19A-J、表20A-J、表21A-K、表22A-K、表23A-J、表24A-K、表25A-G、表26A-G、表27、表29、表31、或表32中任一项的靶向结构域序列相同、或与之相差不多于3个核苷酸的序列。42.如权利要求36所述的核酸，其中所述靶向结构域选自表1A-I、表2A-I、表3A-H、表4A-I、表5A-I、表6A-I、表7A-H、表8A-H、表9A-I、表10A-I、表11A-I、表12A-I、表13A-K、表14A-K、表15A-F、表16A-K、表17A-K、表18A-K、表19A-J、表20A-J、表21A-K、表22A-K、表23A-J、表24A-K、表25A-G、表26A-G、表27、表29、表31、或表32中的那些。43.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述gRNA是模块化gRNA分子。44.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述gRNA是嵌合gRNA分子。45.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个或更多个核苷酸。46.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个核苷酸。47.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是18个核苷酸。48.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是19个核苷酸。49.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是20个核苷酸。50.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是21个核苷酸。51.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是22个核苷酸。52.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是23个核苷酸。53.如权利要求36-42中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是24、25、或26个核苷酸。54.如权利要求36-54中任一项所述的核酸，所述核酸从5’到3’包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；近端结构域；以及尾部结构域。55.如权利要求36-54中任一项所述的核酸，所述核酸包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。56.如权利要求36-54中任一项所述的核酸，所述核酸包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。57.如权利要求36-54中任一项所述的核酸，所述核酸包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少35个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。58.如权利要求36-54中任一项所述的核酸，所述核酸包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。59.如权利要求36-58中任一项所述的核酸，所述核酸进一步包含：(b)编码Cas9分子的序列。60.如权利要求59所述的核酸，其中所述Cas9分子是eaCas9分子。61.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子包括切口酶分子。62.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成双链断裂。63.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成单链断裂。64.如权利要求63所述的核酸，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的与所述gRNA分子的靶向结构域互补的链中。65.如权利要求63所述的核酸，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的不同于与所述gRNA的靶向结构域互补的链的链中。66.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子包含HNH样结构域切割活性，但没有或具有不显著的N-末端RuvC样结构域切割活性。67.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子是HNH样结构域切口酶。68.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子在D10处包含突变。69.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子包含N-末端RuvC样结构域切割活性，但没有或具有不显著的HNH样结构域切割活性。70.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子是N-末端RuvC样结构域切口酶。71.如权利要求60所述的核酸，其中所述eaCas9分子在H840处包含突变。72.如权利要求59所述的核酸，其中所述Cas9分子是eiCas9分子。73.如权利要求72所述的核酸，其中所述Cas9分子是eiCas9-融合蛋白分子(例如eiCas9-转录阻遏因子结构域融合体，例如eiCas9-KRAB结构域融合体)。74.如权利要求36-73中任一项所述的核酸，所述核酸进一步包含：(c)编码在此所描述的第二gRNA分子的序列，所述第二gRNA分子具有与FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC或TRBC基因的第二靶结构域互补的靶向结构域。75.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA分子是如权利要求1-35中任一项所述的gRNA分子。76.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA的靶向结构域被配置成在所述T细胞靶敲除位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。77.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA的靶向结构域被配置成靶向足够接近T细胞靶敲低位置的无酶促活性Cas9(eiCas9)或eiCas9融合蛋白，以减少、降低或阻遏FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的表达。78.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA的靶向结构域被配置成靶向FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、或PTPN6基因的启动子区。79.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA的靶向结构域包含与来自表1A-I、表2A-I、表3A-H、表4A-I、表5A-I、表6A-I、表7A-H、表8A-H、表9A-I、表10A-I、表11A-I、表12A-I、表13A-K、表14A-K、表15A-F、表16A-K、表17A-K、表18A-K、表19A-J、表20A-J、表21A-K、表22A-K、表23A-J、表24A-K、表25A-G、表26A-G、表27、表29、表31、或表32中任一项的靶向结构域序列相同、或与之相差不多于3个核苷酸的序列。80.如权利要求74所述的核酸，其中所述第二gRNA的靶向结构域选自表1A-I、表2A-I、表3A-H、表4A-I、表5A-I、表6A-I、表7A-H、表8A-H、表9A-I、表10A-I、表11A-I、表12A-I、表13A-K、表14A-K、表15A-F、表16A-K、表17A-K、表18A-K、表19A-J、表20A-J、表21A-K、表22A-K、表23A-J、表24A-K、表25A-G、表26A-G、表27、表29、表31、或表32中的那些。81.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子是模块化gRNA分子。82.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子是嵌合gRNA分子。83.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个或更多个核苷酸。84.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是16或17个核苷酸。85.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是18个核苷酸。86.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是19个核苷酸。87.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是20个核苷酸。88.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是21个核苷酸。89.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是22个核苷酸。90.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是23个核苷酸。91.如权利要求74-80中任一项所述的核酸，其中所述靶向结构域在长度上是24、25、或26个核苷酸。92.如权利要求74-91中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子从5’到3’包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；近端结构域；以及尾部结构域。93.如权利要求74-92中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。94.如权利要求74-92中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。95.如权利要求74-92中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少35个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。96.如权利要求74-92中任一项所述的核酸，其中所述第二gRNA分子包含：在长度上不多于25个核苷酸的连接结构域；在长度上至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；以及在长度上17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的靶向结构域。97.如权利要求74-96中任一项所述的核酸，所述核酸进一步包含第三gRNA分子。98.如权利要求97所述的核酸，所述核酸进一步包含第四gRNA分子。99.如权利要求36所述的核酸，所述核酸进一步包含：(b)编码如权利要求59-73中任一项所述的Cas9分子的序列。100.如权利要求99所述的核酸，其中所述核酸不包含(c)编码第二gRNA分子的序列。101.如权利要求10...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·格兰特·威尔斯戴德，阿里·E·弗里德兰，摩根·L·马埃德尔，戴维·A·布姆克罗特，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US